低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收（有机溶剂抽提）

羟乙基修饰的琼脂糖可降低链间的氢键数目，并可在比标准琼脂糖更低的温度下熔化和凝固。多糖链上这种替换发生的程度决定了琼脂糖熔化与凝结的确切温度。这 一特性构成了从凝胶中回收及操作 DNA 的基础（Wielander 1979; Parker and Seed, 1980)。

DNA 样品
乙酸铵 氯仿 乙醇 溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液 载样缓冲液 LMT 洗脱缓冲液 Tris-HCl EDTA 酚 氯仿 平衡饱和酚 TAE 电泳缓冲液 TE
低熔点琼脂糖制备凝胶 Sorvall SS-3 或等同转子 紫外灯 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L）

氯仿

乙醇

溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液

6X 载样缓冲液

LMT 洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8,0)）

酚: 氯仿（1:1，V/V)

平衡饱和酚（pH 8.0)

1X TAE 电泳缓冲液

TE ( pH 8.0)

2. 凝胶

低熔点琼脂糖制备凝胶
 
3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品

4. 离心机及转子

Sorvall SS-3 或等同转子

5. 专用设备

手提式长波段（302 nm ) 紫外灯

预设温度 65℃ 的水浴

二、方法

1. 用 1X TAE 电泳缓冲液灌制一块含有适当浓度的低熔点琼脂糖凝胶。

所以选择 TAE 而非 TBE 有几个理由。主要是 TBE 中的硼酸盐离子能抑制连接反应，并能干扰从玻璃珠上洗脱下来的 DNA 片段的纯化。

2. 待凝胶冷却至室温后，将凝胶连同支撑用的玻璃板一起移至胶盒的水平表面上。

凝胶也可以放在冷室以保证凝胶充分凝固。

3. 将 DNA 样品与载样缓冲液混合，注入到加样孔中，以 3~6 V/cm 的电压进行电泳。

特定分子质量大小的 DNA 在低熔点琼脂糖凝胶中的泳动速度快于常规琼脂糖凝胶。正因为如此，低熔点琼脂糖所加电压应低于常规琼脂糖凝胶。

4. 如需要，用溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液进行染色。用手提式长波（302 nm）紫外灯确定所需条带的确切位置。

5. 用一锋利的刀片或剃刀切下含目的条带的琼脂糖凝胶切片，转移至一个干净的一次性使用的塑料管里。

尽量使切出的琼脂糖切片体积最小，以减少抑制剂对 DNA 的污染量。

6. 切下条带后，进行拍照，从而获得切出条带的记录。

7. 加约 5 倍体积的 LMT 洗脱缓冲液至琼脂糖切片中。盖好管盖，于 65℃ 温育 5 min 熔化凝胶。

8. 待凝胶冷却至室温后，加等体积的平衡酚，将混合液混旋 20 s。在 20℃ 以 4000 g ( Sorvail SS-34 转子 5800 r/min ) 离心 10 min, 回收水相。

9. 再用等体积的酚: 氯仿、氯仿各抽提1次。

10. 水相转移至另一新的离心管中。加 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 4℃ 的无水乙醇。混合液在室温下放置 10 min。然后 4℃，5000 g ( Sorvall SS-34 转子相当于 6500 r/min) 离心 20 min, 沉淀回收 DNA。

11. 用 70% 乙醇清洗沉淀，并溶于适当体积的 TE ( pH 8.0）中。