Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > DNA实验

DNA实验

聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA实验

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
原理这种方法最早由 Richaed Treisman ( 英国,伦敦,ICRF) 参照 Lis 的工作而设计。Lis 是最早用聚乙二醇(PEG ) 分离不同大小


原理

这种方法最早由 Richaed Treisman ( 英国,伦敦,ICRF) 参照 Lis 的工作而设计。Lis 是最早用聚乙二醇(PEG ) 分离不同大小 DNA 的人。Treisman 法被广泛用于碱裂解法制备的质粒 DNA 的纯化。

材料与仪器

粗制质粒
氯仿 乙醇 异丙醇 LiCl PEG-MgCI2 酚 氯仿 乙酸钠 TE
Sorvall SS-34 或与其相当的转头 冰水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

(1) 氯仿

(2) 乙醇

(3) 异丙醇

(4) LiCl ( 5 mol/L)

(5) PEG-MgCI2 溶液

(6) 酚:氯仿(1:1,V/V)

(7) 乙酸钠(3 mol/L, pH 5.2 )

(8) TE ( pH 8.0 )

(9) TE ( pH 8.0)含 20 μg/ml RNase A

2. 核酸和寡核苷酸

粗制质粒

3. 离心机和转头

Sorvall SS-34 或与其相当的转头

4. 专用设备

冰水浴

二、方法

1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中,在冰浴中冷却至 0℃。

2. 加入 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl,混匀,于 4℃ 离心 12000 g ( Sorvall SS-34 转头,10000 r/min ) 10 min。

3. 转移上清至 30 ml Corex 管中,加等体积异丙醇,混匀,室温离心回收核酸,12000 g ( Sorvall SS-34 转头,10000 r/min ) 10 min。

4. 小心倒去上清,倒置管口,使液体流干。室温下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁。小心将乙醇倒去,用真空抽吸器将管壁上残留的乙醇抽干。在纸巾上倒置数分钟,使无可见乙醇残留。但应使沉淀保持湿润。

5. 用 500 μl 含 RNase A 的 TE ( pH8.0 ) 溶解湿润的核酸沉淀。将溶液转移到微量离心管,室温放置 30 min。

6. 将质粒-RNase 混合物用酚:氯仿抽提一次,然后用氯仿抽提一次。

7. 用标准的乙醇沉淀法回收 DNA。

8. 将质粒 DNA 沉淀用 1 ml 灭菌水溶解,再加入 0.5 ml PEG-MgCl2 溶液。

9. 室温放置超过 10 min,然后于室温用微量离心机在最大速度离心 20 min, 以回收沉淀的质粒 DNA。

10. 沉淀用 0.5 ml 70% 乙醇重悬以去除微量 PEG, 用微量离心机在最大速度离心 5 min 以回收核酸。

11. 吸去乙醇,重复步骤10。第二次洗涤后,在离心管架上放置 10~20 min, 使乙醇挥发。

12. 湿润的质粒沉淀用 500 μl TE ( pH 8.0 ) 溶解。以 1:100 用 TE ( pH8.0)稀释后测 OD260 并计算质粒 DNA 的浓度。按 1OD260 =50μg 质粒 DNA/ml 计算。

13. 分装 DNA 并保存于 -20℃。


文章底部广告位

文章评论

加载中~