双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性

1.  加入约0.5 pmol 重组质粒DNA于0.5 ml 微量离心管中，如果体积大于20 μl 应以乙醇沉淀，重溶于20 μl 水。

2.  如果体积小于20 μl，用水补足20 μl。

3.  加入2 μl 2 mol/l NaOH / 2 mmol/l EDTA，用微量移液器上下抽吸轻轻混匀，于25~37℃温育5 min 后，样品置于冰浴，加入水，用微量移液器彻底混匀。

4.  加入75 μl 3 mol/l pH6.0的乙酸钠缓冲液，以中和DNA溶液。

5.  用微量移液器上下抽吸溶液以彻底混匀，滴1 μl 于pH试纸测pH。

6.  然后每1 μl 地逐次加入3 mol/pH6.0缓冲液直至pH≤7.0。

7.  加入75 μl 95%乙醇，干冰放置10 min。

8.  于4 ℃微量离心10  min，小心移去并弃上清。

9.  加入400 μl 70%乙醇，于4℃微量离心10 min，然后小心弃去乙醇。

10.  在Speedvac真空旋转蒸发器中干燥10 min，贮存于20℃（可长达几周）直至作为模板用于双脱氧反应。