测序酶进行标记测序反应
材料与仪器DNA寡核苷酸引物 测序酶终止混合液 测序酶缓冲液 焦磷酸酶混合液离心机 离心管 微量滴定板步骤1. 对于每个单链模板：将下列试剂混合于0.5 ml
材料与仪器
DNA
寡核苷酸引物 测序酶终止混合液 测序酶缓冲液 焦磷酸酶混合液
离心机 离心管 微量滴定板
寡核苷酸引物 测序酶终止混合液 测序酶缓冲液 焦磷酸酶混合液
离心机 离心管 微量滴定板
步骤
1. 对于每个单链模板：将下列试剂混合于0.5 ml 微量离心管中
（1）0.5 pmol 单链DNA模板
（2）0.5 pmol 引物
（3）1 μl 10×测序酶缓冲液
（4）加水至10 μl
（1）0.5 pmol 单链DNA模板
（2）0.5 pmol 引物
（3）1 μl 10×测序酶缓冲液
（4）加水至10 μl
（5）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡）。于65℃温育6 min，然后于37 ℃温育20 min，转到步骤3。
2. 对于每个双链DNA模板：以下列混合液重溶含0.5 pmol 变性双链模板的干燥沉淀物。
（1）1 pmol 引物
（2）1 μl 10×测序酶缓冲液
（3）加水至10 μl
（4）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡），于37℃温育30 min，然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。
3. 当引物正和模板退火时，对应每个待测模板，分别标记好A、C、G、T 4个微量离心管。
DNA测序用酶的特性
3. 分别加入2.5 μl A、C、G、T 测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部
4. 在临用前，才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~ 2 U 测序酶/μl，置于冰浴。
5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中
（1）2 μl 标记混合物
（2）0.5~1.5 μl 10 mCi/ml［α-32P］dATP
（3）2 μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液
（4）总体积在14.5~16 μl，于25℃（室温）温育5 min。
（1）2 μl 标记混合物
（2）0.5~1.5 μl 10 mCi/ml［α-32P］dATP
（3）2 μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液
（4）总体积在14.5~16 μl，于25℃（室温）温育5 min。
6. 加入3.5 μl 标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。
7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀，对 A、C、G、T 管重复此过程，每次均需更换吸头，于37℃温育5~10 min。
7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀，对 A、C、G、T 管重复此过程，每次均需更换吸头，于37℃温育5~10 min。
8. 加入4 μl 终止/加样染料液，于95℃水浴2 min，然后置于冰浴。
9. 每样品各取2~3 μl 加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。
9. 每样品各取2~3 μl 加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。
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