噬菌体克隆的纯化实验基本方案

1.  在直径82 mm LB平极上倒入含200 μl 宿主菌的3 ml 0.7%顶层琼脂糖，放置10 min。

 

2.  通过放射自显影胶片上的杂交斑点确定阳性噬斑在原平板上的位置，用牙签轻轻插入斑中。

3.  然后接种到步骤1制备的次级平板的顶层琼脂糖中，此牙签在平板上接连插30~40下。

 

4.  或用吸管插入阳性噬斑的位置，取一小块环形琼脂糖转入1 ml SM中。

5.  加入1滴氯仿，放置1~2 h，滴定，制备3~6个平板，每个平板的噬斑数应小于500个。

6.  次级平板置37℃过夜培养，将噬菌斑影印到硝酸纤维素滤膜上。

7.  再依次处理、杂交、洗膜和曝光，然后在次级平板上找出对应的阳性噬菌斑。

9.  对每个克隆，将牙签插入杂交信号最强的噬菌斑中，并在1 ml SM中放置5 min。

10.  将1 μl 噬菌体贮存液。1 μl 和10 μl 1：100稀释液铺三级平板。

11.  按以上步骤筛选第三级平板上的噬斑。

12.  重复这一纯化过程，直至获得纯的噬斑为止，并将纯的噬菌体保存在SM中。