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DNA实验

SSR标记实验步骤

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
原理与其它分子标记相比,SSR标记具有以下优点:(1)数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高;(3)以 孟德尔方式


原理

与其它分子标记相比,SSR标记具有以下优点:(1)数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高;(3)以 孟德尔方式遗传,呈共显性;(4)每个位点由设计的引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11,12,18,19,33〕、目标基因的标定〔8,9,21,22,26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到,SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究,因而其开发费用相当高,各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值,且种属特异性较强,目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作,共同进行STMS引物的开发。 

材料与仪器

植物叶片样品
液氮 CTAB 氯仿异戊醇 异丙醇 TE 无水乙醇
离心管 冰箱 水浴锅 离心机

步骤

取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。


1、DNA提取


按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法(`Cetyl triethyl ammonium bromide)并略加改进的程序进行,具体步骤如下:


①  成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状,转入1.5ml离心管中,-20℃冰箱保存;


②  加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟;


③  取出,冷却,上下摇匀后,加入600微升24:1的氯仿异戊醇;


④  12000转/分钟离心10分钟,取上清液于另一个1.5ml的离心管中;


⑤  加异丙醇,12000转/分钟离心10分钟,倒掉上清液;


⑥  干后用100%的洒精清洗,干后加适量TE。2、PCR扩增


模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下:


Sterile ddH2O        11μl


PCR Buffer              3μl


dNTP-mix                 0.5μl


Primer1                     1μl


Primer2                     1μl


Taq polymerase      0.5ul(2U/μl)


DNA                            3μl  


PCR扩增程序为:(2h30min)  


①  预变性:94℃,5分钟;


②  变  性:94℃,40秒;


③  退  火:55℃  40秒;


④  延  伸:72℃,1分钟;


⑤  循  环:从2到4共38个循环;


⑥  72℃下最后延伸5分钟;4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。3、扩增产物的电泳分离


制胶→灌胶→上样→电泳。


扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离,步骤如下:


①  准备电极液(1×TBE);


②  将梳子拨出,并迅速用电极液冲洗胶面;


③  不预电泳;


④  点样,电泳220V;


⑤  拆板,并及时将内板、边条及梳子洗净。


4、凝胶染色


①  固定:10%醋酸,5分钟;


②  染色:10分钟;


③  漂洗:dH2O,5-10秒;


④  显色:甲醛-NaOH,直到满意为止;


⑤  漂洗:dH2O,2分钟。


 5、自封带封胶,读带标记,数码照相摄像,室温风干。

常见问题

1、优点:


(1)标记数量丰富,具有较多的等位变异,广泛分布于各条染色体上;


(2)是共显性标记,呈孟德尔遗传;


(3)技术重复性好,易于操作,结果可靠。


2、缺点:


开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息,而且引物合成费用较高。


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