小量细菌克隆的杂交法筛选实验

主琼脂板上和覆盖于另一块琼脂板表面的硝酸纤维滤膜或尼龙膜上的细菌克隆可以被定位， 经过一段时间，已经在滤膜上生长的克隆可以被原位裂解以备杂交之用。同时，主琼脂板可置于 4℃ 保存，直到筛选的结果出来为止。

E.coli
LB 或 SOB 琼脂板
硝酸纤维素膜 注射器 针头 防水黑色墨汁 木制牙签或接种环

一、材料

1. 培养基

含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。

含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。

2. 专用设备

(1) 硝酸纤维素膜（Millipore HAWP，或类似产品）或尼龙膜。

滤膜不必是无去污剂污染或无菌。

(2) 注射器（3cc )，针头（18 号）和防水黑色墨汁（India 墨汁）

以上材料用于标记滤膜在主琼脂板上的方向。

(3) 木制牙签或接种环。

3. 载体和菌种

E.coli，用于重组质粒转化。

E.coli，用于非重组质粒转化（如 pUC，作为阴性对照）。

二、方法

1. 将硝酸纤维膜或尼龙膜铺于含有选择性抗菌素的琼脂板（实验平板）上。

由于手指上的油会影响滤膜浸湿并妨碍 DNA 转移，操作滤膜时应带上手套。

2. 在一张绘图纸上画出数字标记的方格（方格大小 1 cm2 )，在每一块琼脂主板的底部标记数字，并把琼脂板放在方格纸上，在琼脂板边缘的 6 点钟位置上作好标记。

这样标记将使主板于方格的方向一致。

3. 用无菌牙签或接种环将菌落逐一地转移至实验板的滤膜上和含有选择性抗菌素的主板上（没有滤膜）。按照板下方的方格将菌落划成 2~3 mm 的短线或点，每一菌落在两块板中的位置相同。

一块 90 mm 板可划 100 个克隆。

4. 最后在滤膜和主琼脂板上各划一个含非重组质粒（如 pUC) 的克隆。

阴性对照对于用放射性探针区别空质粒和重组质粒是必要。从重组质粒的限制酶切产物和琼脂糖电泳中提取的 DNA 片段常被质粒 DNA 序列污染，当污染的 DNA 片段用作杂交探针进行转化克隆的 Grunstein-Hogness 筛选时，就会造成麻烦。

5. 倒置琼脂板置于 37℃ 培养直至菌线的宽度校至 0.5~1.0 mm ( 通常需 6~16 h）。

这一阶段，如细菌生长仍然很快，滤膜应转至含有氯霉素的琼脂板，再于 37℃ 进一步培养 12 h（Hanahan and Meselson 1980，1983)。这个扩增的过程只有在重组质粒的拷贝数预计很低的情况下（如插入的是较大的外源 DNA 片段 )，或当简并度较高的寡核苷酸用作探针时，是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通过杂交被检出，不需要预先进行重组质粒的扩增。扩增只对那些以松散方式复制的质粒是有效的。

6. 在三个或更多不对称的位置上标记滤膜，用连在装有防水墨汁注射器上的 18 号针头将滤膜刺穿直至实验板的琼脂中。在主板相近的位置上也作同样标记。

实践中，用空的 18 号针头在滤膜和下层琼脂间穿孔而避免使用墨水（墨水会弄得很脏），是可能的，杂交 后，通过来自光盒的背光可以对滤旗上的孔与琼脂上的痕迹进行校对。

很多研究者更喜欢用剪刀在滤膜四周不同位置上剪出缺口的方法来确定方向。将剪出缺口并作好标记的滤膜置于琼脂表面，而后在培养板背面标记出滤膜锯齿状边缘的位置。这样通过锯齿的形状和位置就可确定在培养板上的方向。

7. 用 Parafilm 膜将主板封好，颠倒后于 4℃ 保存，直至得出杂交实验的结果。

8. 裂解附着于滤膜上细菌，将释放出的 DNA 结合到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。进行杂交。