核酸提取法

【试剂】

1. 蛋白酶 K（10 mg/ml）,-20℃ 保存。

2. TE（pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1 mmol/L EDTA（pH 8.0）, 15 磅高压灭菌后室温保存。

3. 10% SDS：10g SDS 溶于 90ml 水中，加热68℃助溶，加几滴浓盐酸调节 pH 至 7.2，加蒸馏水定容至 100ml，室温保存。

4. 3M NaAc: 800 ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH 值至5.2，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。

5. 饱和氯化钠，70% 乙醇，氯仿

6. 饱和酚

【仪器，耗材】

1. 台式离心机 ；电热恒温水浴箱；冰箱；紫外分光光度计；一次性塑料手套。

2. 微量加样器（1000μl,200μl，20μl）；Tip头（1000μl,200μl，20μl）。Tip 头盒（1000μl,200μl，20μl）；eppendorf f管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff 管架。

饱和氯化钠抽提法提取外周血 DNA

1．取 0.5ml 抗凝全血，加入 0.8ml TE(pH 8.0)混匀；

2．室温离心，10000rpm ，1分钟；

3．弃上清，加入 0.4ml TE(pH 8.0)，混匀，悬浮细胞；

4．加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（终浓度100μg/ml）,10% SDS 25μl(终浓度0.5%)，混匀；

5．37℃ 水浴消化过夜，或 50℃ 消化 4 小时；

6．加入 1/3 体积的饱和氯化钠，充分混匀，4℃ 静置 10 分钟；

7．10000rpm 离心 10 分钟，取上清于另一新管中；

8．加入等体积氯仿，混匀，10000rpm 离心 10 分钟；

9．取上清于另一新管中，加入 1/20 体积的 3M NaAc(pH 5.2)混匀；

10．加入 2 倍体积无水乙醇轻轻混合，10000rpm 离心 1 分钟；

11．弃上清，加入 70% 乙醇 0.5ml，充分洗涤；

12．10000rpm 离心 1 分钟，弃上清，自然干燥 DNA 约 5 分钟；

13．加入 200-250μl TE，-20℃ 保存；

14．检测浓度及纯度。

酚氯仿抽提法提取外周血 DNA

1．外周血反复冻溶破坏红细胞，取 0.5ml 外周血，加入0.5ml PBS混匀后，10000rpm 离心10分钟；

2．弃上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl（终浓度100μg/ml）混匀；

3．37℃ 水浴消化过夜，或 50℃ 消化 4 小时；

4．加入等体积的饱和酚并充分混匀，10000rpm 离心 10 分钟；

5．吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次；

6．吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀， 10000rpm 离心 10 分钟；

7．吸取上清液于另一新管中，加入 1/20 体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后，加入 2 倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色 DNA 团块， 10000rpm 离心 10 分钟；

8．弃上清，加入 70% 乙醇 0.5ml，充分洗涤；

9. 10000rpm 离心 1 分钟，弃上清，自然凉干后加入TE液，-20℃ 保存；

10. 检测浓度及纯度。

组织总 RNA 的提取

1. 将组织用锡箔纸包裹后于液氮中冻 10 min，击碎后回收入 2ml 无菌 Eppendorff 管中。按 50-100mg 组织样品加 1ml TRIZOL试剂进行组织匀浆，样品体积不应超过 TRIZOL 试剂体积的 10%；

2. 将组织匀浆液在 15-30℃ 放置 5min，促使核蛋白复合物完全解离，按 1ml TRIZOL，加入 0.2ml 氯仿，剧烈震荡 15s，15-30℃ 放置 2-3min，在 2-8℃ 离心转速不超过 12000g 离心 15min 将上清液转入新的离心管中(上清液约占 TRIZOL 试剂体积的 60%)；

3. 在上清液中按 1ml TRIZOL试剂(最初匀浆体积)加入 0.5ml 异丙醇混匀，15-30℃ 放置 10min，在 2-8℃ 离心转速不超过 12000g 离心 10min；

4. 弃上清，70% 乙醇洗涤RNA沉淀 (1ml TRIZOL试剂至少加入 1ml 70%乙醇)振荡混匀，在 2-8℃ 离心转速不超过 7500g，离心 5min；

5. 室温或真空干燥 RNA 沉淀，重新溶于 DEPC 水中(55℃-60℃温浴10min)；

6. 紫外分光光度计检测 RNA 浓度和纯度；

7. 1% 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总 RNA，每孔上样 25μg，65V，2.5h，以检测 RNA 的质量。计算已提取的 DNA 的浓度和纯度。

1. 保证核酸一级结构的完整性；

2. 排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰） ；

3. 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 ；

4. 尽可能降低蛋白质、多糖和脂类等大分子物质。