DNA实验

甲醛洋菜胶体电泳

2024-06-13 DNA实验加入收藏

原理rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small r

原理

rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs，这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

材料与仪器

RNA样品
formaldehyde gel running buffer Formaldehyde gel loading buffer Ethidium bromide DEPC
恒温水槽微量离心机 Mupid II 迷你电泳槽铸胶器 UV transilluminator 防护面罩拍立得相机抽气橱

步骤

一、实验材料准备

1. 仪器用具

65℃恒温水槽；微量离心机；Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器；UV transilluminator;防护面罩；拍立得相机；抽气橱。

2. 药品试剂

自菌体抽取的RNA （I-1, I-2, U-1, and U-2）与胞外转录反应所制备的正意股及反意股RNA （#1, #2, #3, and #4）。

5xformaldehyde gel running buffer （0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA）

Formaldehyde gel loading buffer （0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA）

Ethidium bromide （1 ug/uL in dH2O/DEPC）

dH2O/DEPC

二、方法步骤

1. 准备一片1.2%甲醛洋菜胶体

（1）秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶，加入25 mL dH2O/DEPC。

（2）以微波炉加热溶解的后，微微晃动血清瓶使混合均匀，再移至60℃恒温水槽静置5 min。

（3）将装着agarose 溶液的血清瓶移至抽气橱，加入8 mL 的5x formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛，轻轻摇晃血清瓶以便混合均匀。

胶体总体积为40 mL，为了避免agarose 溶液因温度快速下降，很快便凝固，应力求动作迅速，但应避免剧烈摇晃，以免弄出一大堆气泡，影响胶体凝结。

（4）尽速于抽气橱内把混合液倒入胶体铸模，并插入样本梳（teeth comb）。胶体凝固至少需时30 min。

2. 电泳

（1）要进行电泳时，把已凝固的洋菜胶体放进电泳槽，并加入适量1x formadehyde gel running buffer。

（2）以50 V 定电压预跑5 min。

（3）依序注入上列8 个RNA 样本，以50 V 定电压进行电泳，待追踪染剂移动至胶体三分的二处时，关闭电源，将胶体移至UV transilluminator box，观察RNA 色带的存在情形，并拍照存证。

注意：这一片胶体往下将用来进行北方转印实验，请小心处置！

注意事项

1. 本实验主要参照Sambrook and Russell （2001）的方法。

2. 进行本实验时请务必戴手套。

3. 甲醛与formamide 都放在抽气橱内。

常见问题

1. 在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。

2. 由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作。

3. 此外，含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA 占细胞RNA总量的80-85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S）。

4. 散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。