基于 PCR 的差减 cDNA 克隆实验基本方案

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 对每一组 ds cDNA （A 和 B）配制 2 个限制性内切核酸酶消化反应（AluI 和 AluI＋Rsal）：

30 ng ds cDNA

3 ul 10×AluI 缓冲液

10 U AluI 或 10 U AluI＋10 U RsaI

加水到 30.0 ul。

37℃ 温育过夜，确保完全消化。

最好使用产生平端的酶。如果不是产生平端的酶，需要另外补平或削平。

2. 65℃温育超过10 min失活内切酶。

3. 激酶处理寡核苷酸 a1 和 b1， 使用如下反应体系（每个反应体系 25 ul）：

18.0 ul H2O

2.5 ul 10 mmol/L ATP

2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液

1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1

0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶

37℃ 温育 60 min。

4. 65℃温育20 min失活激酶。

5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 连接子。混匀，最高速离心。45℃ 温育 10 min。

6.在 0.5 ml 的 PCR 管里，用合适的连接子为每组 cDNA 配制连接反应（130 ul 每个反应）：

63 ul H2O

13 ul 10× T4 DNA 连接酶缓冲液

30 ul 40％ PEG 8000

1ul 15 mmol/L ATP

10 ul AluI 消化的 cDNA

10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA

2 ul a1/a2 或 b1/b2 连接子

1ul 10 U/ul T4 DNA 连接酶

混匀，16℃温育2 h。

7. 将反应管放于冰上超过10 min。

8. 根据厂家说明书准备 Sephacryl S-300 离心柱。

9. 每个连接反应中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 温育 30 min。

10. 用 1 倍体积的 25：24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提连接反应。

11. 连接产物离心过 Sephacryl S-300离心柱 ，除去未连接的连接子，用 Beckman Accuspin FR 离心机的吊桶转子室温，400 g 离心 2 min。

12. 两组 cDNA ， 各配制 50 ul PCR反应体系：

35 ul H2O

5 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液

3 ul 25 mmol/L MgCl2

1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物

0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2

5 ul 0.2 ng/ul 连接好的 cDNA A 或 cDNA B

0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶

加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。

13. 用下面的 PCR 程序扩增 cDNA ：

30 个循环：

1min 94℃ （变性）

1 min 50℃ （复性）

2 min 72℃ （延伸）

25 s 72℃ （自动延伸）

对于没有自动延伸的热循环仪，延长延伸时间为 2～4 min。

14. 用琼脂糖凝胶电泳分析 5～10 ul 扩增好的 cDNA， 确定扩增 cDNA 的大小范围 （150 bp～1. 5 kb， 大部分为 250 bp）

15. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制以下由放射性标记的测试 cDNA 的 PCR 反应体系 （每个反应体系 100 ul）：

77 ul H2O

10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液

6 ul 25 mmol/L MgCl2

2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物

1 ul 稀释的［32P］ dCTP

1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2

2 ul A0 或 B0 cDNA （约 0.4 ug）

1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶

加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。

16. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制 3 或4 个由生物素标记的驱动 cDNA 的 PCR 反应体系（每个反应体系100 ul）：

73.3 ul H2O

10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液

6 ul 25 mmol/L MgCl2

6.7 ul 驱动 dNTP

1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2

2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 （1～５ ng）

1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶

加入几滴无菌的 PCR 级矿物油覆盖反应体系。

17. 用步骤 13 中的 PCR 扩增程序进行测试和驱动 cDNA 的合成。

18. 按厂家说明，用商业化的阴离子交换 PCR 离心柱（Qiagen）纯化扩增的 cDNA，去除未掺入的核苷酸、引物和盐。

19. 用分光光度计定量产物核酸。

20. 配制 2 个杂交反应（［32P］ An-Bio-Bn 和［32P］ Bn-Bio-An）。在一个 1.5 ml 硅烷化的微量离心管里，用乙醇沉淀 1 ug 放射性标记的测试 DNA 和 20 ug 的生物素标记的驱动 DNA，不要冷冻。风干沉淀，当沉淀刚刚干时，用吸头轻轻吹吸，重新溶于 5 ul HEPES 缓冲液。用手提式盖格计数器检测重新溶解的核酸溶液。

21. 转移重新溶解的 DNA 到一个 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 杂交缓冲液进行差减杂交。轻轻吹吸混匀，加入数滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖 DNA 溶液。最高速离心几秒。

22. 把两个管子在 95℃加热 10 min， 然后在 1 h 内慢慢冷却到 68℃，并继续在 68℃温育 2 h （快速杂交）。

23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 缓冲液，加热到 68℃。加入到杂交反应中稀释反应。混匀，最高速简单离心。冷却到室温。

24. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提前的总量计算）。

25. 每管中加入15 ul 链霉亲和素，涡旋混匀，室温温育 5 min。

26. 每管用等体积的 25：24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相转移到新的管里。

27. 每管的水相中加入 10 ul 链霉亲和素。混匀，室温温育 5 min。

28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提两次。测量每管的水相体积。

29. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提后的总量计算）。

被去除掉的测试cDNA的百分比用以下等式估算：

％ 去除的测试CDNA＝100 一（酚抽提后总量 ×100/酿抽提前总量）

30. 用 An 或 Bn 测试 cDNA 和合适的驱动 cDNA 重复差减的过程（步骤 15～29）。驱动 cDNA 的选择由差减的策略决定。用 An 或 Bn 驱动 cDNA 进行快速杂交（2 h），用 A0 或 B0 驱动 cDNA 进行长时间杂交（30～40 h）。差减的进程用隙缝斑点杂交检测。

31. 用步骤 13 的程序扩增 5 ul 差减 cDNA （An 和 Bn）。用一个商业化的阴离子交换 PCR 离心柱纯化 PCR产物（如Qiagen）。

32. 用在连接子上有剪切位点的合适限制酶（针对于这里所用的连接子，如 Ec0RI 和 EcoRV）消化 cDNA。

33. 苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化消化的 cDNA。

34. 把 DNA 连接到合适的载体中（如 EcoRI 或 EcoRV 切开的 pBluescript）。

35. 转化载体到感受态细菌里。

36. 铺板培养差减文库。

值得先通过滴定文库以获得单克隆。确定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。

插入片段应当是 250 bp 左右。如果插入的片段 ＞500 bp， 则可以认为是插入了两个片段。

37. 从每个起始滤膜制备 4 个重复的印迹。

38. 按照厂家说明，变性、中和和交联印迹。

39. 用差减探针杂交这些重复的滤膜。

40. 从库里随机（如果估计库里绝大多数是差异表达的基因）或按照探针的杂交结果挑取 50～100 个差异表达的克隆。准备小量的质粒 DNA。

41. 对每个质粒里的插入片段进行测序，把含有相同序列的克隆归在一起。

42. 用起始组织的 RNA 分 析 ［如 Northern 印迹、 RNase 保护分析、定量 RT-PCR 或者原位杂交确定这些克隆是否确实是差异表达的。

1. 材料

A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA）

2. 试剂

ALuI 和 10×ALuI 缓冲液

RsaI

10、15 和 75 mmol/L 的 ATP

10 U/ul T4 多聚核苷酸激酶和 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液

寡核苷酸引物

3 ug/ul a1： 5'-TAG TCC GAA TTC AAG CAA GAG CAC A-3’

2.5 ug/ul a2： 5'-CTC TTG CTT GAA TTC GGA CTA-3'

3 ug/ul B1： 5'-ATG CTG GAT ATC TTG GTA CTC TTC A-3'

2.5 ug/ul B2： 5'-GAG TAC CAA GAT ATC CAG CAT-3’

10 U/ul T4 DNA连接酶和 10×T4 DNA连接酶缓冲液

40％（m/V）聚乙二醇 8000（PEG 8000）

25：24（V/V）苯酚/氯仿（平衡酚配制）

氯仿

5 U/ul Taq DNA聚合酶和 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液

25 mmol/L MgCl2

10 mmol/L 4dNTP 混合物

矿物油，PCR级，无菌

800Ci/mmol ［α-32P］ dCTP （10 Ci/ul）

驱动 dNTP 混合物

乙醇

1 mol/L 和 5 mol/L NaCl

HEPES缓冲液

2× 差减杂交缓冲液

链霉亲和素溶液

EcoRI 和 10×EcoRI 缓冲液或 EcoRV 和 10× EcoRV 缓冲液

EcoRI 切开的 pBluescript 载体

EcoRV 切开的 pBluescript 载体

转化感受态菌株

3. 耗材

放射性标记的差减探针

0.5 ml 的 PCR 管

Sephacryl S-300 离心柱（Amersham Pharmacia Biotech）

Beckman Accuspin FR离心机和吊桶转子或类似的其他离心机

热循环仪

阴离子交换PCR离心柱（Qiagen）

1.5 ml微量离心管，硅烷化

手提式盖格计数器

加热块