箝位匀强电场的脉冲场凝胶电泳
原理箝位匀强电场（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF) 凝胶电泳中， 电场是由多个电极产生的。这些
原理
箝位匀强电场（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF) 凝胶电泳中， 电场是由多个电极产生的。这些电极围绕水平凝胶呈四边形或六边形，其电位被箝制在顶先设定的水平（Chuetal. 1986; Vollrath and Davis 1987; Chu 1990a)。周边呈四边 形时产生的电场彼此间的夹角是直角；六边形产生的电场夹角是 60°或 120°，取决于凝胶的位置和电极的极性。
材料与仪器
DNA 大小标准 目的基因组 DNA
变性缓冲液 凝胶电泳缓冲液
优质琼脂糖 CHEF 凝胶设备 循环水浴 水浴
变性缓冲液 凝胶电泳缓冲液
优质琼脂糖 CHEF 凝胶设备 循环水浴 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
变性缓冲液（0.5 N NaOH，1.5 mol/L NaCI）
溴化乙锭（1 μg/ml）或适当稀释度的 SYBR Gold
0.5X TBE 凝胶电泳缓冲液
2. 凝胶
优质琼脂糖
3. 核酸和寡核苷酸
DNA 大小标准
目的基因组 DNA
4. 专用设备
CHEF 凝胶设备
循环水浴
14℃ 水浴
二、方法
CHEF 分离 DNA 片段
1. 用 0.5 X TBE 缓冲液配制适当浓度的琼脂糖凝胶后灌铸。用气泡水平仪监测以保证托盘在实验台上完全水平。室温下让凝胶硬化 1 h。
2. 将胶置于 CHEF 设备中，加入足够的 0.5X TBE 刚好没过凝胶，剩余的缓冲液冷却至 14℃。
3. 制备好含有目的 DNA 的琼脂糖栓，进行限制酶消化。制备和包埋 DNA 大小标准品。
4. 轻轻地分别将栓放入微型离心管中，每管中加入 200 μl 0.5 x TBE, 室温温育 15 min。
5. 经过消化和洗涤的 DNA 栓分别包埋在凝胶加样孔中，利用熔化的制胶琼脂糖封住凝胶栓。
6. 让封栓的凝胶硬化约 5 min, 加入额外的 0.5X TBE 缓冲液（先前步骤 2 冷却至 14℃ 的）完全盖住胶。
7. 启动缓冲液循环，电力供应条件电泳。
8. 电泳结束后，室温下，溴化乙锭或适当稀释度的 SYBR Gold 室温染色 30 min。水中脱色 30 min, 紫外灯下照相。
DNA 变性转移到尼龙膜
9. 照相后，凝胶于 250 ml 变性缓冲液中轻微振摇温育 30 min。更换变性缓冲液后再温育 30 min。
10. 在变性缓冲液中利用毛细管印迹直接将 DNA 转移到尼龙膜上。
11. 转移后，80℃, 2 h 烘烤或紫外交联或微波处理将 DNA 固定在尼龙膜上。
12. 在含有甲酰胺的缓冲液中用标记探针进行预杂交和杂交。
1. 缓冲液和溶液
变性缓冲液（0.5 N NaOH，1.5 mol/L NaCI）
溴化乙锭（1 μg/ml）或适当稀释度的 SYBR Gold
0.5X TBE 凝胶电泳缓冲液
2. 凝胶
优质琼脂糖
3. 核酸和寡核苷酸
DNA 大小标准
目的基因组 DNA
4. 专用设备
CHEF 凝胶设备
循环水浴
14℃ 水浴
二、方法
CHEF 分离 DNA 片段
1. 用 0.5 X TBE 缓冲液配制适当浓度的琼脂糖凝胶后灌铸。用气泡水平仪监测以保证托盘在实验台上完全水平。室温下让凝胶硬化 1 h。
2. 将胶置于 CHEF 设备中，加入足够的 0.5X TBE 刚好没过凝胶，剩余的缓冲液冷却至 14℃。
3. 制备好含有目的 DNA 的琼脂糖栓，进行限制酶消化。制备和包埋 DNA 大小标准品。
4. 轻轻地分别将栓放入微型离心管中，每管中加入 200 μl 0.5 x TBE, 室温温育 15 min。
5. 经过消化和洗涤的 DNA 栓分别包埋在凝胶加样孔中，利用熔化的制胶琼脂糖封住凝胶栓。
6. 让封栓的凝胶硬化约 5 min, 加入额外的 0.5X TBE 缓冲液（先前步骤 2 冷却至 14℃ 的）完全盖住胶。
7. 启动缓冲液循环，电力供应条件电泳。
8. 电泳结束后，室温下，溴化乙锭或适当稀释度的 SYBR Gold 室温染色 30 min。水中脱色 30 min, 紫外灯下照相。
DNA 变性转移到尼龙膜
9. 照相后，凝胶于 250 ml 变性缓冲液中轻微振摇温育 30 min。更换变性缓冲液后再温育 30 min。
10. 在变性缓冲液中利用毛细管印迹直接将 DNA 转移到尼龙膜上。
11. 转移后，80℃, 2 h 烘烤或紫外交联或微波处理将 DNA 固定在尼龙膜上。
12. 在含有甲酰胺的缓冲液中用标记探针进行预杂交和杂交。
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