中性聚丙烯酰胺凝胶电泳
材料与仪器DNA 样品丙烯酰胺 亚甲双丙烯酰胺 过硫酸铵 乙醇 凝胶载样缓冲液 KOH 甲醇 硅化液 TBE 电泳缓冲液 TEMED夹子或铁皮制纸夹 电泳装置
材料与仪器
DNA 样品
丙烯酰胺 亚甲双丙烯酰胺 过硫酸铵 乙醇 凝胶载样缓冲液 KOH 甲醇 硅化液 TBE 电泳缓冲液 TEMED
夹子或铁皮制纸夹 电泳装置 玻璃板 梳子和间隔片 凝胶密封带 凝胶测温条 微量移液器及拉长的塑料洗头 凡士林 注射器
丙烯酰胺 亚甲双丙烯酰胺 过硫酸铵 乙醇 凝胶载样缓冲液 KOH 甲醇 硅化液 TBE 电泳缓冲液 TEMED
夹子或铁皮制纸夹 电泳装置 玻璃板 梳子和间隔片 凝胶密封带 凝胶测温条 微量移液器及拉长的塑料洗头 凡士林 注射器
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺（29:1) (%, m/V)
过硫酸铵（10%，m/V）
乙醇
6X 凝胶载样缓冲液
KOH/甲醇
硅化液（如 Sigmacote 或 Acrylease)(可选或不选）
5X TBE 电泳缓冲液
TEMED
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 样品
3. 专用设备
夹子或铁皮制纸夹（6~8 个，2 inch/5 cm 宽）
电泳装置，玻璃板，梳子和间隔片
凝胶密封带
凝胶测温条（可选或不选）
微量移液器及拉长的塑料洗头
凡士林
注射器（50 ml)
二、方法
安装电泳装置和配制凝胶溶液
1. 必要时可用 KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片。
2. 用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水。应拿取玻璃板的边缘部分或戴手套操作，以免手上的油脂残留在玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板，并将其置于一边晾干。
3. (可做可不做）其中一块玻璃板的一面用硅化液处理（如 Sigmacote 或 Acrylease): 在化学通风橱内，将玻璃板放于一叠纸巾上，倒少量硅化液于其表面上，用 Kimwipes 纸巾涂抹均匀，然后用去离子水冲洗、纸巾擦干。
4. 安装玻璃与间隔片：
(1) 将较大的（不带凹口）玻璃板平放在实验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行置于其边缘放妥。
(2) 用凡士林轻涂以助于间隔片在后面的操作中保持原位。
(3) 将内板（带凹口的玻璃板）在间隔片上放妥。
(4) 用夹子或铁皮制纸夹将玻璃板夹在一起，将整块玻璃板的两边及底部用凝胶密封带封紧，形成不透水密封。
5. 根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。制备适宜浓度的凝胶溶液。
6. (可做可不做）将所需用量的聚丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液放于一干净的带侧臂的烧瓶中，加入磁力搅拌子，抽真空脱气。开始脱气应温和一些，并边脱气边旋转烧瓶直至不再有气泡溢出为止。
灌制凝胶
7. 下面的操作需要戴手套，在托盘上进行，以免溅出的丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液洒在实验台上。动作应迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。
(1) 每 100 ml 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液中加入 35 μl TEMED, 轻轻旋转混匀溶液。
(2) 用 50 ml 注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液，几乎注满该空隙。
(3) 将玻璃板斜靠在试管架上，与实验台面成约 10° 角。
8. 立即将合适的梳子插入到凝胶中，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。用铁皮制纸夹将梳子夹紧，使其就位。必要时，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充满模具。确认无丙烯酰胺溶液从模具里漏出。
9. 丙烯酰胺于室温聚合 30~60 min。若凝胶回缩明显，应补加丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液。
10. 聚合完全后，用 1X TBE 浸润的纸巾包绕梳子和凝胶的顶部。然后用 Saran Wrap 膜密封整块凝胶，4℃ 保存，直至使用。
11. 当准备好进行电泳时，在梳子的周围及其顶部喷些 1X TBE 缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子。用注射器吸取 1X TBE 冲洗加样孔。用剃须刀或解剖刀除去凝胶底部的密封胶带。
上样与电泳
12. 将凝胶放入电泳槽中，用大号铁皮制夹子夹住其进缘或用装置本身的夹子固定。带凹口的玻璃板应面对缓冲液槽向里放置。
13. 用配制凝胶溶液同一批次的 5X TBE 配制电泳缓冲液灌满缓冲液槽。用一根弯头巴斯德吸管或注射器针头排除藏匿于凝胶底部的气泡。
14. 用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1X TBE 冲洗加样孔。将 DNA 样品与适量 6X 凝胶载样缓冲液混合，用 Hamilton 注射器或带有拉长的塑料吸头的微量移液管加入加样孔。
15. 将电极与电源相连（正极接下槽)，打开电源，进行电泳。
16. 电泳至标准参照染料迁移至所需位置。关闭电源，拔掉插头，弃去电泳槽中的电泳缓冲液。
17. 卸下玻璃板，用解剖刀或剃须刀片除去凝胶密封胶带。将玻璃板放在实验台上 （硅化的玻璃板在上面)。用间隔片或塑料楔将上面的玻璃板的一角撬起。检査一下凝胶仍应附着在下面的玻璃板上。将上面的玻璃板平稳的移开，去掉间隔片。
18. 检测聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 条带的位置。
1. 缓冲液和溶液
丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺（29:1) (%, m/V)
过硫酸铵（10%，m/V）
乙醇
6X 凝胶载样缓冲液
KOH/甲醇
硅化液（如 Sigmacote 或 Acrylease)(可选或不选）
5X TBE 电泳缓冲液
TEMED
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 样品
3. 专用设备
夹子或铁皮制纸夹（6~8 个，2 inch/5 cm 宽）
电泳装置，玻璃板，梳子和间隔片
凝胶密封带
凝胶测温条（可选或不选）
微量移液器及拉长的塑料洗头
凡士林
注射器（50 ml)
二、方法
安装电泳装置和配制凝胶溶液
1. 必要时可用 KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片。
2. 用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水。应拿取玻璃板的边缘部分或戴手套操作，以免手上的油脂残留在玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板，并将其置于一边晾干。
3. (可做可不做）其中一块玻璃板的一面用硅化液处理（如 Sigmacote 或 Acrylease): 在化学通风橱内，将玻璃板放于一叠纸巾上，倒少量硅化液于其表面上，用 Kimwipes 纸巾涂抹均匀，然后用去离子水冲洗、纸巾擦干。
4. 安装玻璃与间隔片：
(1) 将较大的（不带凹口）玻璃板平放在实验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行置于其边缘放妥。
(2) 用凡士林轻涂以助于间隔片在后面的操作中保持原位。
(3) 将内板（带凹口的玻璃板）在间隔片上放妥。
(4) 用夹子或铁皮制纸夹将玻璃板夹在一起，将整块玻璃板的两边及底部用凝胶密封带封紧，形成不透水密封。
5. 根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。制备适宜浓度的凝胶溶液。
6. (可做可不做）将所需用量的聚丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液放于一干净的带侧臂的烧瓶中，加入磁力搅拌子，抽真空脱气。开始脱气应温和一些，并边脱气边旋转烧瓶直至不再有气泡溢出为止。
灌制凝胶
7. 下面的操作需要戴手套，在托盘上进行，以免溅出的丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液洒在实验台上。动作应迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。
(1) 每 100 ml 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液中加入 35 μl TEMED, 轻轻旋转混匀溶液。
(2) 用 50 ml 注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液，几乎注满该空隙。
(3) 将玻璃板斜靠在试管架上，与实验台面成约 10° 角。
8. 立即将合适的梳子插入到凝胶中，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。用铁皮制纸夹将梳子夹紧，使其就位。必要时，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充满模具。确认无丙烯酰胺溶液从模具里漏出。
9. 丙烯酰胺于室温聚合 30~60 min。若凝胶回缩明显，应补加丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液。
10. 聚合完全后，用 1X TBE 浸润的纸巾包绕梳子和凝胶的顶部。然后用 Saran Wrap 膜密封整块凝胶，4℃ 保存，直至使用。
11. 当准备好进行电泳时，在梳子的周围及其顶部喷些 1X TBE 缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子。用注射器吸取 1X TBE 冲洗加样孔。用剃须刀或解剖刀除去凝胶底部的密封胶带。
上样与电泳
12. 将凝胶放入电泳槽中，用大号铁皮制夹子夹住其进缘或用装置本身的夹子固定。带凹口的玻璃板应面对缓冲液槽向里放置。
13. 用配制凝胶溶液同一批次的 5X TBE 配制电泳缓冲液灌满缓冲液槽。用一根弯头巴斯德吸管或注射器针头排除藏匿于凝胶底部的气泡。
14. 用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1X TBE 冲洗加样孔。将 DNA 样品与适量 6X 凝胶载样缓冲液混合，用 Hamilton 注射器或带有拉长的塑料吸头的微量移液管加入加样孔。
15. 将电极与电源相连（正极接下槽)，打开电源，进行电泳。
16. 电泳至标准参照染料迁移至所需位置。关闭电源，拔掉插头，弃去电泳槽中的电泳缓冲液。
17. 卸下玻璃板，用解剖刀或剃须刀片除去凝胶密封胶带。将玻璃板放在实验台上 （硅化的玻璃板在上面)。用间隔片或塑料楔将上面的玻璃板的一角撬起。检査一下凝胶仍应附着在下面的玻璃板上。将上面的玻璃板平稳的移开，去掉间隔片。
18. 检测聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 条带的位置。
相关文章
