电穿孔转染 DNA 实验
材料与仪器指数生长的哺乳动物细胞培养液Giemsa 染液 甲醇 磷酸盐缓冲液 丁酸钠 载体 DNA 细胞生长培养基组织培养皿 基因脉冲器 II 电穿孔设备与电转
材料与仪器
指数生长的哺乳动物细胞培养液
Giemsa 染液 甲醇 磷酸盐缓冲液 丁酸钠 载体 DNA 细胞生长培养基
组织培养皿 基因脉冲器 II 电穿孔设备与电转化池 Sorvall H1000B 转子或类似设备
Giemsa 染液 甲醇 磷酸盐缓冲液 丁酸钠 载体 DNA 细胞生长培养基
组织培养皿 基因脉冲器 II 电穿孔设备与电转化池 Sorvall H1000B 转子或类似设备
步骤
材料
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液至所需浓度
Giemsa 染液（10%m/V)
Giemsa 染液应使用前用磷酸盐缓冲液或水新鲜制备的，用 Whatman1 号滤纸过。
甲醇
磷酸盐缓冲液
溶液使用前过滤除菌，室温保存
丁酸钠（500 mmol/L)(备选）
在化学通风橱内，用10mol/LNaOH 调节丁酸贮存液至 pH7.0。用 0.22um 的滤器过滤除菌，-20°C 保存
核酸与寡核苷酸
载体 DNA(10mg/ml; 如超声处理的鲑精 DNA)(选用）
线状或环状质粒 DNA(用灭菌去离子水配成 1ug/ul)
培养基
细胞生长培养基（完全培养基与选择性培养基）
离心机与转子
Sorvall H1000B 转子或类似设备
特殊设备
电穿孔设备与电转化池
基因脉冲器 II(Bio-Rad 公司 Cat.oo.165-2105for 110V U.S.Systems and Cat.no.165-2106 for 220V European Systems)。
组织培养皿（35 mm)
此方法适用于用 35 mm 培养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他直径的培养皿，按比例改变细胞浓度与试剂的用量，见表 16-3。
附加试剂
本方案第 10 步可能需要列于第 17 章方案 7 或方案 1 的备选方案中的试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养液
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色
方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
• 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好（1）用每一构建体转染数个培养皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）将细胞汇集起来；以及（4）重铺细胞于数个培养血上
11. 分离稳定转染体：用完全培养基培养 48~72 h 后，胰酶消化细胞，用适当的选择性培养基重铺细胞。每 2~4 天换液一次，持续 2~3 周，目的是去除死细胞残骸，并允许抗性细胞克隆生长。此后，克隆、繁殖独立克隆以用于检测 [方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(〈细胞实验手册〉 的第 86 章）]。
用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室温下用10% Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目 Giemsa 染液应在使用前用磷酸盐缓冲液或水新配置，用 Whatman l 号滤纸过滤。 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液至所需浓度
Giemsa 染液（10%m/V)
Giemsa 染液应使用前用磷酸盐缓冲液或水新鲜制备的，用 Whatman1 号滤纸过。
甲醇
磷酸盐缓冲液
溶液使用前过滤除菌，室温保存
丁酸钠（500 mmol/L)(备选）
在化学通风橱内，用10mol/LNaOH 调节丁酸贮存液至 pH7.0。用 0.22um 的滤器过滤除菌，-20°C 保存
核酸与寡核苷酸
载体 DNA(10mg/ml; 如超声处理的鲑精 DNA)(选用）
线状或环状质粒 DNA(用灭菌去离子水配成 1ug/ul)
培养基
细胞生长培养基（完全培养基与选择性培养基）
离心机与转子
Sorvall H1000B 转子或类似设备
特殊设备
电穿孔设备与电转化池
基因脉冲器 II(Bio-Rad 公司 Cat.oo.165-2105for 110V U.S.Systems and Cat.no.165-2106 for 220V European Systems)。
组织培养皿（35 mm)
此方法适用于用 35 mm 培养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他直径的培养皿，按比例改变细胞浓度与试剂的用量，见表 16-3。
附加试剂
本方案第 10 步可能需要列于第 17 章方案 7 或方案 1 的备选方案中的试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养液
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色
方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
• 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好（1）用每一构建体转染数个培养皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）将细胞汇集起来；以及（4）重铺细胞于数个培养血上
11. 分离稳定转染体：用完全培养基培养 48~72 h 后，胰酶消化细胞，用适当的选择性培养基重铺细胞。每 2~4 天换液一次，持续 2~3 周，目的是去除死细胞残骸，并允许抗性细胞克隆生长。此后，克隆、繁殖独立克隆以用于检测 [方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(〈细胞实验手册〉 的第 86 章）]。
用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室温下用10% Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目 Giemsa 染液应在使用前用磷酸盐缓冲液或水新配置，用 Whatman l 号滤纸过滤。 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
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