DEAE-葡聚糖介导的高效率转染实验
材料与仪器指数生长的哺乳动物细胞二磷酸氯喹 DEAE-葡聚糖磷酸盐缓冲液 含葡萄糖的 Tris-缓冲盐溶液 质粒 DNA 细胞生长培养基组织培养皿步骤材料缓冲液
材料与仪器
指数生长的哺乳动物细胞
二磷酸氯喹 DEAE-葡聚糖磷酸盐缓冲液 含葡萄糖的 Tris-缓冲盐溶液 质粒 DNA 细胞生长培养基
组织培养皿
二磷酸氯喹 DEAE-葡聚糖磷酸盐缓冲液 含葡萄糖的 Tris-缓冲盐溶液 质粒 DNA 细胞生长培养基
组织培养皿
步骤
材料
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液至所需浓度。
二磷酸氯喹（100 mmol/L)
溶解 60 mg 二磷酸氯喹于 lml 去离子水中。用 0.22um 滤纸过滤溶液。滤液存于箔纸包裹的试管内，-20°C 保存。
见信息栏中二磷酸氯喹
DEAE-葡聚糖（50 mg/ml)
溶解 100 mgDEAE-葡聚糖（相对分子质量=500000;Pharmacia 公司）于 2 ml 去离子水中。溶液于 15pai(1.05 kg/cm2) 液体循环高压灭菌 20 min。高压也有助于聚合物的溶解。
最初用于转染的 DEAE-葡聚糖分子质量大于 2x106(McCutchan and Pagano1968)。这种 DEAE-葡聚糖现在已经买不到了，但某些实验室会偶有存货。这种老批次的高分子质量 DEAE-葡聚耱的转染效率髙于现在常用的低分子质量聚合物。
磷酸盐缓冲液（PBS)
使用前过滤除菌，室溫保存。
含葡萄糖的 Tris-缓冲盐溶液（TBS-D)
使用前于 TBS 溶液中加入 20%(m/V) 葡萄糖（用水制备，高压灭菌或过滤除菌)。蔔萄糖终浓度应为 0.1%(V/V)。
核酸与寡核苷酸
质粒 DNA
为得到最高转染效率，应用层析柱（见第 1 章方案 9) 或 CsCl?溴化乙锭密度梯度离心（见第 1 章方案 10) 纯化质粒 DNA。
培养基
细胞生长培养基（完全培养基与无血清培养基）
特殊设备
组织培养皿（60 mm 或 35 mm)
此方法适用于用 60 mm 或 35 mm 堉养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他宜径的培养皿，按比例改变细胞浓度与试剂的用量。见表 16-3。
附加试剂
本方案第 8 步所需试剂列于第 6 章方案 1 与第 7 章方案 8。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞
方法
1. 转染 24 h 前，通过胰酶消化收获指数生长的细胞并以 105 细胞/培养皿（或 5x104 细胞/35 mm 培养皿）的密度转移至 60 mm 培养皿中。加 5 ml(35 mm 培养皿 3 ml) 完全培养基，于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱内培养细胞 20~24 h。
转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长少于 12 h, 细胞不易貼壁，加入 DEAE 葡聚糖后容易脱壁。
2. 将 0.1~4ug 超螺旋或环状 DNA 与 1 mg/mlTBS-D 溶解的 DEAE-葡聚糖混合制备 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。
每 60 mm 培养皿需 0.25 ml 溶液; 每 35 mm 培养皿需 0.15 ml 溶液。
要获得髙水平瞬时表达所需 DNA 的量取决于构建体的性质，应在预实验中摸索合适的用量。如果构建体携带在转染细胞内能发挥作用的复制子（如，SV40 早期区域启动子/复制起点），每 105 细胞用 100~200ngDNA 即可；如果无复制子，则需要的 DNA 要多一些（每 105 细胞 1ugDNA)。
3. 吸去培养基，用预热（37°C) 的 PBS 洗涤细胞两次，用预热的 TBS-D 洗涤细胞一次。
4. 加入 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液（每 60 mm 培养皿 250 每 35 mm 培养皿 150ul)。轻轻振动培养皿使溶液均匀覆盖于细胞层上。将培养皿放回孵箱培养 30~90 min(培养的时间取决于各批细胞对 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液的敏感度）。每隔 15~20 min, 从孵箱中取出培养皿，轻轻摇动，在显微镜下检査细胞形态。如果细胞仍然贴壁，则继续培养。当细胞开始萎缩并变圆时停止培养。
5. 吸去 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。用预热的 TBS-D 洗涤细胞一次，再用预热 (37°C) 的 PBS 洗涤细胞一次，注意不要吸走转染的细胞。
6. 加 5 ml(每 60 mm 培养皿) 或 3 ml(每 35 mm 培养皿）预热的含血淸与氯喹（终浓度 100umol/L) 的培养基，在 CO2 浓度为 5%~7% 的 37°C 孵箱内培养 3~5 h。
用氯喹处理细胞后转染效率会增加败倍，可能是因为氯喹抑制溶酶体水解酶降解 DNA(Lutbman and Magnusson1983), 但应注意，DEAE-葡聚糖与氯喹的混合物会产生严重的细胞毒效果。因此应在预实验中确定 DEAE-葡聚糖处理后的细胞接触氯喹的最长时间（详情见信息栏中二磷酸氯喹）。
7. 吸去培养基，用无血清培养基洗涤细胞 3 次。加入 5 ml(每 60 mm 培养皿）或 3 ml(每 35 mm 培养皿）预热的含血清培养基，在 CO2 浓度为 5%~7% 的 37°C 解箱内培养 36~60 h, 然后检测转染 DNA 的瞬时表达。
应优化特定细胞系与构建体的孵育时间。
8. 要检测转染细胞对导入 DNA 的瞬时表达，于转染后 36~60 h 收获细胞。通过杂交分析 RNA 或 DNA。通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好 (1) 用每一构建体转染数个培养皿；(2) 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；(3) 将细胞汇集起来；以及 (4) 重铺细胞于数个培养皿上。
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液至所需浓度。
二磷酸氯喹（100 mmol/L)
溶解 60 mg 二磷酸氯喹于 lml 去离子水中。用 0.22um 滤纸过滤溶液。滤液存于箔纸包裹的试管内，-20°C 保存。
见信息栏中二磷酸氯喹
DEAE-葡聚糖（50 mg/ml)
溶解 100 mgDEAE-葡聚糖（相对分子质量=500000;Pharmacia 公司）于 2 ml 去离子水中。溶液于 15pai(1.05 kg/cm2) 液体循环高压灭菌 20 min。高压也有助于聚合物的溶解。
最初用于转染的 DEAE-葡聚糖分子质量大于 2x106(McCutchan and Pagano1968)。这种 DEAE-葡聚糖现在已经买不到了，但某些实验室会偶有存货。这种老批次的高分子质量 DEAE-葡聚耱的转染效率髙于现在常用的低分子质量聚合物。
磷酸盐缓冲液（PBS)
使用前过滤除菌，室溫保存。
含葡萄糖的 Tris-缓冲盐溶液（TBS-D)
使用前于 TBS 溶液中加入 20%(m/V) 葡萄糖（用水制备，高压灭菌或过滤除菌)。蔔萄糖终浓度应为 0.1%(V/V)。
核酸与寡核苷酸
质粒 DNA
为得到最高转染效率，应用层析柱（见第 1 章方案 9) 或 CsCl?溴化乙锭密度梯度离心（见第 1 章方案 10) 纯化质粒 DNA。
培养基
细胞生长培养基（完全培养基与无血清培养基）
特殊设备
组织培养皿（60 mm 或 35 mm)
此方法适用于用 60 mm 或 35 mm 堉养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他宜径的培养皿，按比例改变细胞浓度与试剂的用量。见表 16-3。
附加试剂
本方案第 8 步所需试剂列于第 6 章方案 1 与第 7 章方案 8。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞
方法
1. 转染 24 h 前，通过胰酶消化收获指数生长的细胞并以 105 细胞/培养皿（或 5x104 细胞/35 mm 培养皿）的密度转移至 60 mm 培养皿中。加 5 ml(35 mm 培养皿 3 ml) 完全培养基，于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱内培养细胞 20~24 h。
转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长少于 12 h, 细胞不易貼壁，加入 DEAE 葡聚糖后容易脱壁。
2. 将 0.1~4ug 超螺旋或环状 DNA 与 1 mg/mlTBS-D 溶解的 DEAE-葡聚糖混合制备 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。
每 60 mm 培养皿需 0.25 ml 溶液; 每 35 mm 培养皿需 0.15 ml 溶液。
要获得髙水平瞬时表达所需 DNA 的量取决于构建体的性质，应在预实验中摸索合适的用量。如果构建体携带在转染细胞内能发挥作用的复制子（如，SV40 早期区域启动子/复制起点），每 105 细胞用 100~200ngDNA 即可；如果无复制子，则需要的 DNA 要多一些（每 105 细胞 1ugDNA)。
3. 吸去培养基，用预热（37°C) 的 PBS 洗涤细胞两次，用预热的 TBS-D 洗涤细胞一次。
4. 加入 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液（每 60 mm 培养皿 250 每 35 mm 培养皿 150ul)。轻轻振动培养皿使溶液均匀覆盖于细胞层上。将培养皿放回孵箱培养 30~90 min(培养的时间取决于各批细胞对 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液的敏感度）。每隔 15~20 min, 从孵箱中取出培养皿，轻轻摇动，在显微镜下检査细胞形态。如果细胞仍然贴壁，则继续培养。当细胞开始萎缩并变圆时停止培养。
5. 吸去 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。用预热的 TBS-D 洗涤细胞一次，再用预热 (37°C) 的 PBS 洗涤细胞一次，注意不要吸走转染的细胞。
6. 加 5 ml(每 60 mm 培养皿) 或 3 ml(每 35 mm 培养皿）预热的含血淸与氯喹（终浓度 100umol/L) 的培养基，在 CO2 浓度为 5%~7% 的 37°C 孵箱内培养 3~5 h。
用氯喹处理细胞后转染效率会增加败倍，可能是因为氯喹抑制溶酶体水解酶降解 DNA(Lutbman and Magnusson1983), 但应注意，DEAE-葡聚糖与氯喹的混合物会产生严重的细胞毒效果。因此应在预实验中确定 DEAE-葡聚糖处理后的细胞接触氯喹的最长时间（详情见信息栏中二磷酸氯喹）。
7. 吸去培养基，用无血清培养基洗涤细胞 3 次。加入 5 ml(每 60 mm 培养皿）或 3 ml(每 35 mm 培养皿）预热的含血清培养基，在 CO2 浓度为 5%~7% 的 37°C 解箱内培养 36~60 h, 然后检测转染 DNA 的瞬时表达。
应优化特定细胞系与构建体的孵育时间。
8. 要检测转染细胞对导入 DNA 的瞬时表达，于转染后 36~60 h 收获细胞。通过杂交分析 RNA 或 DNA。通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好 (1) 用每一构建体转染数个培养皿；(2) 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；(3) 将细胞汇集起来；以及 (4) 重铺细胞于数个培养皿上。
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