琼脂板上裂解性感染实验
材料与仪器λgtll 噬菌体重组体 E.coli Y1090 hsdR 菌株对照覆盖溶液 IPTG 覆盖溶液 SM 溶液 LB 琼脂板 LB 培养液 LB 顶层
材料与仪器
λgtll 噬菌体重组体 E.coli Y1090 hsdR 菌株
对照覆盖溶液 IPTG 覆盖溶液 SM 溶液 LB 琼脂板 LB 培养液 LB 顶层琼脂
Sorvall SS-34 转子或同等产品 空气培养箱
对照覆盖溶液 IPTG 覆盖溶液 SM 溶液 LB 琼脂板 LB 培养液 LB 顶层琼脂
Sorvall SS-34 转子或同等产品 空气培养箱
步骤
材料
缓冲液及溶液
关于贮存液，缓冲液，试剂组分见附录 I。
用前稀释贮存液至合适浓度。
对照覆盖溶液（每个分析的重组噬斑需 6 ml)
10 mmol/LMgSO4
0.5X LB 培养液
LB 配方见附录 2，高压灭菌后加入 1mol/LMgSO4 使终浓度为 10 mmol/L, 每个 150 mm 琼脂板需 6 ml 本溶液
IPTG 覆盖溶液（每个分析重组噬斑需 12 ml)
0.5XLB 培养液
5 mmol/L IPTG
10 mmol/L MgS04
LB 配方见附录 2.0.5xLB 培养液高压灭菌加 1mol/L IPTG(2.38 gIPTG 溶于终体积为 10 ml 的无菌水中）与 1mol/L MgSO4 (24.6 gMgSO4•7 H2O 溶于终体积为 100 ml 的无菌水中)，使其终浓度分别为5nmol/L 和 10mmol/L。每 150 mm 琼脂板需 12 ml IPTG 覆盖溶液MgSO4•7 H20(1mol/L)
SM 溶液
培养基
LB 琼脂板（150 mm)
室溫平衡的新鲜铺制的平板效果最佳。
含 50ul/ug 氨苄青霉素的 LB 培养液
含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 顶层琼脂
离心机及转子
Sorvall SS-34 转子或同等产品
专用设备
预设在 4°C 的空气培养箱
载体及细菌株
λgtll 噬菌体重组体
吸单个噬斑加到约 100ulSM 中室温放置至少 2 h 制成已知滴度的λ噬菌体重组体贮存液，或通过平板裂解液制备（见第 2 章方案 3)
E.coli Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通过 ATCC(www.atcc.org) 获得，在含有 50ul 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上保存，此菌株在编码 ATP 依赖的蛋白酶的基因携带有突变。在此菌株表达的融合蛋白比在不携带这个突变的菌株中要稳定的多。
方法
1. 取大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株的单个克隆，接种到 50 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液中，37°C 过夜培养并温和振荡（摇床 250r/min)。
2. 将培养物转移至离心管中，室温 4000 g(SorvallSS-34 型转子 5800r/min) 离心 5 min。
3. 去上清，用 20 ml10 mmol/LMgSO4 重悬细胞，测定细胞悬液稀释 100 倍时 OD600 值。用 10 mmol/LMgSO4 稀释细胞悬液使 OD600 值达到 2.0 OD600/ml, 制成铺板贮存液。
4. 取 3 管 0.2 ml 小份大肠杆菌 Y1090 hsdR 铺板贮存液转移至新鲜的管中，其中 2 管加 2X105 到 5x106pfu 的重组λgtll 噬菌体贮存液，第三个管做未感染对照。37°C 温育 20 min, 以使噬菌体吸附到细胞上。
5. 向一管中加入 7.5 ml 含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨苄青霉素的熔化的 LB 顶层琼脂，混匀，迅速将顶层琼脂铺到 150 mmLB 琼脂板上。
6. 重复步骤 5 直至全部管均完成。
7.42°C 温育琼脂板 4 h。
8. 从培养箱中取出平板，向一个感染的平板加 6 ml 对照覆盖液，另外两管中加 12 mlIPTG 覆盖液。
9. 重新放回 42°C 培养箱 3~5 h。
10. 从培养箱中取出平板，将覆盖液转人单个的无菌管中。
融合蛋白裂解后立即从感染的细胞中释放出来与覆盖液混合。多数细菌碎片留在琼脂糖中而不会污染覆盖液。
每 150 mm 平板可产生 200ug 融合蛋白。根据 Huang 和 Jong（1984) 介绍的方法，毎板最多可以重复锈导 5 次，但最大表达量是在前两次诱导中产生。重复诱导时，可移去混有蛋白质的覆盖液，平板在 37°C 复活 1 h, 再加入新鲜覆盖液即可。
本方案还可进行变通（LillibridgeandPhilipp1993), 表达目的融合蛋白的重组噬菌体可在大肠杆菌菌苔上形成一个大的巨型噬斑。将噬菌斑与其下的琼脂一同挖走. 在匀浆器中破碎，2XSDS 上样缓冲液中重悬，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹。从制备噬斑开始到凝胶电泳，整个操作过程需约 6.5 h。
11. 通过免疫印迹检测覆盖液中的融合蛋白。若原始噬菌体是按方案 6 所述的方法分离的，则可用 DNA 结合实验进行检测。
在未感染的培养物或不含 IFTG 覆盖液中是检测不到免疫反应性及 DNA 结合性的。检测酶活性时，分析前覆盖液应用适当的缓冲液进行透析。
12. 利用试剂盒可通过亲和层析纯化覆盖液中的β-半乳糖苷酶融合蛋白（如 Promega Proto Sorb), 或按第 15 章方案 1 中所述方法进行。纯化蛋白质前应先对覆盖液进行透析以除去 IPTG。
缓冲液及溶液
关于贮存液，缓冲液，试剂组分见附录 I。
用前稀释贮存液至合适浓度。
对照覆盖溶液（每个分析的重组噬斑需 6 ml)
10 mmol/LMgSO4
0.5X LB 培养液
LB 配方见附录 2，高压灭菌后加入 1mol/LMgSO4 使终浓度为 10 mmol/L, 每个 150 mm 琼脂板需 6 ml 本溶液
IPTG 覆盖溶液（每个分析重组噬斑需 12 ml)
0.5XLB 培养液
5 mmol/L IPTG
10 mmol/L MgS04
LB 配方见附录 2.0.5xLB 培养液高压灭菌加 1mol/L IPTG(2.38 gIPTG 溶于终体积为 10 ml 的无菌水中）与 1mol/L MgSO4 (24.6 gMgSO4•7 H2O 溶于终体积为 100 ml 的无菌水中)，使其终浓度分别为5nmol/L 和 10mmol/L。每 150 mm 琼脂板需 12 ml IPTG 覆盖溶液MgSO4•7 H20(1mol/L)
SM 溶液
培养基
LB 琼脂板（150 mm)
室溫平衡的新鲜铺制的平板效果最佳。
含 50ul/ug 氨苄青霉素的 LB 培养液
含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 顶层琼脂
离心机及转子
Sorvall SS-34 转子或同等产品
专用设备
预设在 4°C 的空气培养箱
载体及细菌株
λgtll 噬菌体重组体
吸单个噬斑加到约 100ulSM 中室温放置至少 2 h 制成已知滴度的λ噬菌体重组体贮存液，或通过平板裂解液制备（见第 2 章方案 3)
E.coli Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通过 ATCC(www.atcc.org) 获得，在含有 50ul 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上保存，此菌株在编码 ATP 依赖的蛋白酶的基因携带有突变。在此菌株表达的融合蛋白比在不携带这个突变的菌株中要稳定的多。
方法
1. 取大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株的单个克隆，接种到 50 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液中，37°C 过夜培养并温和振荡（摇床 250r/min)。
2. 将培养物转移至离心管中，室温 4000 g(SorvallSS-34 型转子 5800r/min) 离心 5 min。
3. 去上清，用 20 ml10 mmol/LMgSO4 重悬细胞，测定细胞悬液稀释 100 倍时 OD600 值。用 10 mmol/LMgSO4 稀释细胞悬液使 OD600 值达到 2.0 OD600/ml, 制成铺板贮存液。
4. 取 3 管 0.2 ml 小份大肠杆菌 Y1090 hsdR 铺板贮存液转移至新鲜的管中，其中 2 管加 2X105 到 5x106pfu 的重组λgtll 噬菌体贮存液，第三个管做未感染对照。37°C 温育 20 min, 以使噬菌体吸附到细胞上。
5. 向一管中加入 7.5 ml 含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨苄青霉素的熔化的 LB 顶层琼脂，混匀，迅速将顶层琼脂铺到 150 mmLB 琼脂板上。
6. 重复步骤 5 直至全部管均完成。
7.42°C 温育琼脂板 4 h。
8. 从培养箱中取出平板，向一个感染的平板加 6 ml 对照覆盖液，另外两管中加 12 mlIPTG 覆盖液。
9. 重新放回 42°C 培养箱 3~5 h。
10. 从培养箱中取出平板，将覆盖液转人单个的无菌管中。
融合蛋白裂解后立即从感染的细胞中释放出来与覆盖液混合。多数细菌碎片留在琼脂糖中而不会污染覆盖液。
每 150 mm 平板可产生 200ug 融合蛋白。根据 Huang 和 Jong（1984) 介绍的方法，毎板最多可以重复锈导 5 次，但最大表达量是在前两次诱导中产生。重复诱导时，可移去混有蛋白质的覆盖液，平板在 37°C 复活 1 h, 再加入新鲜覆盖液即可。
本方案还可进行变通（LillibridgeandPhilipp1993), 表达目的融合蛋白的重组噬菌体可在大肠杆菌菌苔上形成一个大的巨型噬斑。将噬菌斑与其下的琼脂一同挖走. 在匀浆器中破碎，2XSDS 上样缓冲液中重悬，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹。从制备噬斑开始到凝胶电泳，整个操作过程需约 6.5 h。
11. 通过免疫印迹检测覆盖液中的融合蛋白。若原始噬菌体是按方案 6 所述的方法分离的，则可用 DNA 结合实验进行检测。
在未感染的培养物或不含 IFTG 覆盖液中是检测不到免疫反应性及 DNA 结合性的。检测酶活性时，分析前覆盖液应用适当的缓冲液进行透析。
12. 利用试剂盒可通过亲和层析纯化覆盖液中的β-半乳糖苷酶融合蛋白（如 Promega Proto Sorb), 或按第 15 章方案 1 中所述方法进行。纯化蛋白质前应先对覆盖液进行透析以除去 IPTG。
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