细菌克隆的溶解实验
原理具有原噬菌体的细菌称为溶原性细菌。噬菌体分为烈性噬菌体和溶原性噬菌体，在感染于寄主细菌细胞时，前者往往在菌体内增殖并将菌体裂解。材料与仪器大肠杆菌 噬菌体I
原理
具有原噬菌体的细菌称为溶原性细菌。噬菌体分为烈性噬菌体和溶原性噬菌体，在感染于寄主细菌细胞时，前者往往在菌体内增殖并将菌体裂解。
材料与仪器
大肠杆菌 噬菌体
IPTG 溶源菌抽提缓冲液 氯化钠 溶菌酶 LB 琼脂平板
气体恒溫箱 液氮 Millipore 滤纸 水浴摇床 牙签或接种环 噬菌体λgt11 λgt18-23 λZAP 和λZipLox 重组子 大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株
IPTG 溶源菌抽提缓冲液 氯化钠 溶菌酶 LB 琼脂平板
气体恒溫箱 液氮 Millipore 滤纸 水浴摇床 牙签或接种环 噬菌体λgt11 λgt18-23 λZAP 和λZipLox 重组子 大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录 1。
将贮存液稀释到适当的浓度。
IPTG(1mol/L)
诱导每升溶源菌需要大约 40ul lmol/L 的 IPTG。
溶源菌抽提缓冲液
50mml/L Tris-Cl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
5 mmol/L 二硫苏糖醇
50ug/ml 苯甲基磺酰氟化物（PMSF)
进行步骤 13 和 18 之前在溶源菌抽提缓冲液中加入 PMSF。每诱导 20 溶源菌需要大约 100 ml 溶源菌抽提缓冲液。
氯化钠（5mol/L)
于 4℃贮存 NaCl 溶液。
酶和缓冲液
溶菌酶（10 mg/ml)
在10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中溶解固体溶菌酶（分于生物学级）使其浓度为 10 mg/ml。需在进行步骤 15 时新鲜配制该溶液。
培养基
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板
LB 培养基
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基
含 10 mmol/LMgCl2 的 LB 培养基
含 10 mmd/LMgCl2,0.2%(m/V) 麦芽糖和 5Oug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基
专用设备
气体恒溫箱调整至 32℃和 42℃
液氮
Millipore 滤纸
138 mm 圆形滤纸（Millipore 型 VS,0.0025um 孔径滤纸）用于透析溶解产物，每张滤纸可以透析 20 溶解产物。
水浴摇床调整至 44℃
如果无水浴摇床，在 44℃ 水浴即可。
牙签或接种环
附加试剂
本方案步骤 1 所需试剂见第 2 章方案 3。
载体和菌株
噬菌体λ;gt11,λgt18-23,λZAP 和λZipLox 重组子
本方案优化了噬菌体λgt11 重组子表达重组融合蛋白（可以采用方案 1 或方案 6 中所列的方法或杂交和 DNA 序列分析来鉴别）的方法。在其他多种λ噬菌体表达载体上构建的重组子可用于本节所述的溶源菌的构建。
大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株
这些菌株可以从 ATCC(www.atcc.org) 获得并在含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上保存。Y1090 和 Y1089 菌株带有 lon 基因的突变，lon 基因编码一种 ATP 依賴的蛋白酶。这些菌株表达的融合蛋白质常常比那些没有发生突变的菌株更稳定。Y1089 带有 hflA 突变. 该突变可显著增加λ噬菌体发生溶源菌现象的频率。另外，Y1089 缺乏一种 tRNA 基因抑制子，这样，在λgtll 的 S 基因（溶解基因）上的琥珀突变在此菌株中不能够被抑制，结果大量λ噬菌体编码的基因产物包括 LacZ 融合蛋白质）在被诱导细胞内高水平聚集。如需了解大肠杆菌 Y1090 和 Y1089 菌株的其他资料，请见信息栏中质粒和λ噬菌体表达载体的相关内容。
方法
1. 按第 2 章方案 2~3 介绍的方法制备各特定重组噬菌体的平板原种，根据在大肠杆菌 Y1090 hsdR 株进行的测定，原种的滴度应大于 1010pfu/ml。
2. 大肠杆菌 Y1090 hsdR 株在 2 mlLB 培养基中生长至饱和，培养基中补充 0.2% 麦芽糖、50ug/ml 氨苄青霉素和 10 mmol/LMgCl2。
3. 用 2 ml 含 10 mmol/LMgCl2 的 LB 培养基稀释 50ul 上述饱和菌液，分到另外 4 个培养管中，每管 100ul。
4. 在 3 支管内分别加入 1X107、5X107 及 2X108 噬斑形成单位（pfu) 的噬菌体原种。第四管内不加噬菌体。于 37℃ 温育 20 min, 使病毒吸附。
5. 从 4 管培养物中各吸取 100 稀释在 10 mlLB 培养基中，立即从各稀释菌液中吸取少量（100ul) 铺到含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，于 32℃ 温育平板 18~24 h。
接种未感染大肠杆菌 Y1090hsdR 株菌液的平板上不应出现菌落，而感染的培养物则会产生 50~500 个菌落，这取决于最初饱和菌液的密度和噬菌体的确切感染复数。
6. 使用无菌牙签，挑取单个菌落放到两个含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，两块平板分别置于 32℃ 和 42℃ 温育 12~16 h。凡所出现的菌落在 32℃生长而在 42℃ 不生长的克隆，即为重组λ噬菌体的溶源性克隆，通常在所检测菌落中有 10%~70% 溶源菌。
7. 以单个噬菌体溶源菌接种于 2 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素 LB 培养基中，于 32℃ 剧烈振荡培养 12~16 h(300r/min)。
8. 从每个培养管中吸取 50ul 加到 4 ml 预温（32℃) 的 LB 培养基 (含 50ug/ml 氨苄青霉素）中，32℃ 继续剧烈振荡培养。
9. 细菌培养物生长至 OD600=0.45(约培养 3 h)。
重要：诱导溶源菌之前，细菌堉养物 OD600 不应超过 0.5(约 2X108 个细菌/ml)。
10. 把培养物转移到温度已达到 44℃ 的水浴中温育 15 min。
温度迅速从 32℃ 升至 44℃ 诱导效果最佳。据此将培养物转移到设定在 44℃ 的恒溫水浴要优于干热培养箱。44℃ 培养时应不断剧烈振荡培养物。
加热到此溫度只是部分失活 cIts857 阻遏物，当培养物冷却到 37℃ 时又可恢复活性（Mandal and Lieb1976)。但是，阻遏物的浓度太低，无法阻止 Cro 蛋白的合成，而 Cro 蛋白又可与 OR3 结合进而阻止阻遏物的合成。加热后，培养物进入了一个不可逆的噬菌体裂解性生长循环。
11. 每管培养物中加入 IPTG 至终浓度为 10 mmol/L。于 37℃ 剧烈振荡培养 1 h。
12. 将 1.5 ml 经过诱导的溶源培养物转入 2 个微量离心管内，立即于以最大转速离心 30s。
13. 吸出培养液，加入 100ul 溶源菌抽提缓冲液，迅速通过振荡重悬细菌沉淀。
14. 盖紧管盖，置于液氮中。
15.2 min 后，将离心管从液氮中取出。握在手中至裂解液刚刚融化，各管内迅速加入20ul 10 mg/ml 的溶菌液，在冰浴中放置 15 min。
16. 各管中加入 250ul 5 ml/LNaCl。用手指轻弹管壁混匀内容物，在转轮上于温育 30 min。
17. 于 4℃ 以最大转速离心 30 min。
18. 离心过程中，4℃ 下将溶源菌抽提缓冲液倾注于一个平皿（150 mm)，再将 Millipore滤膜（VS 型 0.025um 孔径）漂浮在液面上。
最好在冷室僻静角落中进行操作，注意不要让溶源菌抽提缓冲液溅到滤膜的上表面。
19. 将上清液从离心管中转移至滤膜上表面，一张滤膜可加入多达 20 个不同样品。
20. 在 4℃ 放置 l~2 h 后，再将透析后的样品吸到另一个微量离心管中，用前在-70℃ 保存。
21. 用甲基化保护实验、DNA 酶 I 足迹法或凝胶电泳 DNA 结合实验（凝胶电泳迁移率滞后实验）等方法分析裂解液中的 DNA 结合蛋白。
纯化融合蛋白可通过购买亲和层析试剂盒来实现（如 PntoSotb lacZ 免疫亲和吸附剂，Promega) 或按第 15 章所述方法进行。
裂解原液或纯化的融合蛋白可用来检测外源蛋白酶活性或通过免疫印迹来检测其免疫化学交叉反应性。
纯化的融合蛋白可用来产生抗外源蛋白质的抗体，此抗体可用于鉴定一段 cDNA 编码的蛋白质（可通过组织鉴定或部分纯化分析)，或抑制某种酶的活性或通过亲和层析纯化天然外源蛋白质。
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录 1。
将贮存液稀释到适当的浓度。
IPTG(1mol/L)
诱导每升溶源菌需要大约 40ul lmol/L 的 IPTG。
溶源菌抽提缓冲液
50mml/L Tris-Cl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
5 mmol/L 二硫苏糖醇
50ug/ml 苯甲基磺酰氟化物（PMSF)
进行步骤 13 和 18 之前在溶源菌抽提缓冲液中加入 PMSF。每诱导 20 溶源菌需要大约 100 ml 溶源菌抽提缓冲液。
氯化钠（5mol/L)
于 4℃贮存 NaCl 溶液。
酶和缓冲液
溶菌酶（10 mg/ml)
在10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中溶解固体溶菌酶（分于生物学级）使其浓度为 10 mg/ml。需在进行步骤 15 时新鲜配制该溶液。
培养基
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板
LB 培养基
含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基
含 10 mmol/LMgCl2 的 LB 培养基
含 10 mmd/LMgCl2,0.2%(m/V) 麦芽糖和 5Oug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基
专用设备
气体恒溫箱调整至 32℃和 42℃
液氮
Millipore 滤纸
138 mm 圆形滤纸（Millipore 型 VS,0.0025um 孔径滤纸）用于透析溶解产物，每张滤纸可以透析 20 溶解产物。
水浴摇床调整至 44℃
如果无水浴摇床，在 44℃ 水浴即可。
牙签或接种环
附加试剂
本方案步骤 1 所需试剂见第 2 章方案 3。
载体和菌株
噬菌体λ;gt11,λgt18-23,λZAP 和λZipLox 重组子
本方案优化了噬菌体λgt11 重组子表达重组融合蛋白（可以采用方案 1 或方案 6 中所列的方法或杂交和 DNA 序列分析来鉴别）的方法。在其他多种λ噬菌体表达载体上构建的重组子可用于本节所述的溶源菌的构建。
大肠杆菌 Y1090 hsdR 菌株及 Y1089 菌株
这些菌株可以从 ATCC(www.atcc.org) 获得并在含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上保存。Y1090 和 Y1089 菌株带有 lon 基因的突变，lon 基因编码一种 ATP 依賴的蛋白酶。这些菌株表达的融合蛋白质常常比那些没有发生突变的菌株更稳定。Y1089 带有 hflA 突变. 该突变可显著增加λ噬菌体发生溶源菌现象的频率。另外，Y1089 缺乏一种 tRNA 基因抑制子，这样，在λgtll 的 S 基因（溶解基因）上的琥珀突变在此菌株中不能够被抑制，结果大量λ噬菌体编码的基因产物包括 LacZ 融合蛋白质）在被诱导细胞内高水平聚集。如需了解大肠杆菌 Y1090 和 Y1089 菌株的其他资料，请见信息栏中质粒和λ噬菌体表达载体的相关内容。
方法
1. 按第 2 章方案 2~3 介绍的方法制备各特定重组噬菌体的平板原种，根据在大肠杆菌 Y1090 hsdR 株进行的测定，原种的滴度应大于 1010pfu/ml。
2. 大肠杆菌 Y1090 hsdR 株在 2 mlLB 培养基中生长至饱和，培养基中补充 0.2% 麦芽糖、50ug/ml 氨苄青霉素和 10 mmol/LMgCl2。
3. 用 2 ml 含 10 mmol/LMgCl2 的 LB 培养基稀释 50ul 上述饱和菌液，分到另外 4 个培养管中，每管 100ul。
4. 在 3 支管内分别加入 1X107、5X107 及 2X108 噬斑形成单位（pfu) 的噬菌体原种。第四管内不加噬菌体。于 37℃ 温育 20 min, 使病毒吸附。
5. 从 4 管培养物中各吸取 100 稀释在 10 mlLB 培养基中，立即从各稀释菌液中吸取少量（100ul) 铺到含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，于 32℃ 温育平板 18~24 h。
接种未感染大肠杆菌 Y1090hsdR 株菌液的平板上不应出现菌落，而感染的培养物则会产生 50~500 个菌落，这取决于最初饱和菌液的密度和噬菌体的确切感染复数。
6. 使用无菌牙签，挑取单个菌落放到两个含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上，两块平板分别置于 32℃ 和 42℃ 温育 12~16 h。凡所出现的菌落在 32℃生长而在 42℃ 不生长的克隆，即为重组λ噬菌体的溶源性克隆，通常在所检测菌落中有 10%~70% 溶源菌。
7. 以单个噬菌体溶源菌接种于 2 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素 LB 培养基中，于 32℃ 剧烈振荡培养 12~16 h(300r/min)。
8. 从每个培养管中吸取 50ul 加到 4 ml 预温（32℃) 的 LB 培养基 (含 50ug/ml 氨苄青霉素）中，32℃ 继续剧烈振荡培养。
9. 细菌培养物生长至 OD600=0.45(约培养 3 h)。
重要：诱导溶源菌之前，细菌堉养物 OD600 不应超过 0.5(约 2X108 个细菌/ml)。
10. 把培养物转移到温度已达到 44℃ 的水浴中温育 15 min。
温度迅速从 32℃ 升至 44℃ 诱导效果最佳。据此将培养物转移到设定在 44℃ 的恒溫水浴要优于干热培养箱。44℃ 培养时应不断剧烈振荡培养物。
加热到此溫度只是部分失活 cIts857 阻遏物，当培养物冷却到 37℃ 时又可恢复活性（Mandal and Lieb1976)。但是，阻遏物的浓度太低，无法阻止 Cro 蛋白的合成，而 Cro 蛋白又可与 OR3 结合进而阻止阻遏物的合成。加热后，培养物进入了一个不可逆的噬菌体裂解性生长循环。
11. 每管培养物中加入 IPTG 至终浓度为 10 mmol/L。于 37℃ 剧烈振荡培养 1 h。
12. 将 1.5 ml 经过诱导的溶源培养物转入 2 个微量离心管内，立即于以最大转速离心 30s。
13. 吸出培养液，加入 100ul 溶源菌抽提缓冲液，迅速通过振荡重悬细菌沉淀。
14. 盖紧管盖，置于液氮中。
15.2 min 后，将离心管从液氮中取出。握在手中至裂解液刚刚融化，各管内迅速加入20ul 10 mg/ml 的溶菌液，在冰浴中放置 15 min。
16. 各管中加入 250ul 5 ml/LNaCl。用手指轻弹管壁混匀内容物，在转轮上于温育 30 min。
17. 于 4℃ 以最大转速离心 30 min。
18. 离心过程中，4℃ 下将溶源菌抽提缓冲液倾注于一个平皿（150 mm)，再将 Millipore滤膜（VS 型 0.025um 孔径）漂浮在液面上。
最好在冷室僻静角落中进行操作，注意不要让溶源菌抽提缓冲液溅到滤膜的上表面。
19. 将上清液从离心管中转移至滤膜上表面，一张滤膜可加入多达 20 个不同样品。
20. 在 4℃ 放置 l~2 h 后，再将透析后的样品吸到另一个微量离心管中，用前在-70℃ 保存。
21. 用甲基化保护实验、DNA 酶 I 足迹法或凝胶电泳 DNA 结合实验（凝胶电泳迁移率滞后实验）等方法分析裂解液中的 DNA 结合蛋白。
纯化融合蛋白可通过购买亲和层析试剂盒来实现（如 PntoSotb lacZ 免疫亲和吸附剂，Promega) 或按第 15 章所述方法进行。
裂解原液或纯化的融合蛋白可用来检测外源蛋白酶活性或通过免疫印迹来检测其免疫化学交叉反应性。
纯化的融合蛋白可用来产生抗外源蛋白质的抗体，此抗体可用于鉴定一段 cDNA 编码的蛋白质（可通过组织鉴定或部分纯化分析)，或抑制某种酶的活性或通过亲和层析纯化天然外源蛋白质。
注意事项
裂解原液或纯化的融合蛋白可用来检测外源蛋白酶活性或通过免疫印迹来检测其免疫化学交叉反应性。
纯化的融合蛋白可用来产生抗外源蛋白质的抗体，此抗体可用于鉴定一段 cDNA 编码的蛋白质（可通过组织鉴定或部分纯化分析），或抑制某种酶的活性或通过亲和层析纯化天然外源蛋白质。
常见问题
纯化融合蛋白可通过购买亲和层析试剂盒来实现（如 PntoSotb lacZ 免疫亲和吸附剂，Promega) 。
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