外切核酸酶 Ⅲ 消化产生多组嵌套缺失突变体
材料与仪器dNTP 溶液 乙醇 外切核酸酶Ⅲ缓冲液 核酸酶 S1 停止反应混合液 酚 氯仿 醋酸钠 外切核酸酶Ⅲ Klenow 混合物 连接混合物 核酸酶 S1
材料与仪器
dNTP 溶液 乙醇 外切核酸酶Ⅲ缓冲液 核酸酶 S1 停止反应混合液 酚 氯仿 醋酸钠 外切核酸酶Ⅲ Klenow 混合物 连接混合物 核酸酶 S1 反应混合物 限制性内切酶 凝胶 靶 DNA
微量离心管或带 U-型孔的微量滴定板 水浴装置
微量离心管或带 U-型孔的微量滴定板 水浴装置
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分清参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。
dNTP 溶液中含有 dATP、dGTP 和 dTTP, 每种 dNTP 浓度为 0.5 mmol/L，溶在 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
乙醇（100%, 冰冷；70%, 室温。)
10x 外切核酸酶Ⅲ缓冲液
660 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
66 mmol/LMgCl2
100 mmol/Lβ-巯基乙醇
核酸酶 S1 停止反应混合液
0.3 mmol/L Tris
50 mmol/L EDTA(pH8-0)
酚：氯仿
醋酸钠（3mol/L,pH5.2)
酶和缓冲液
外切核酸酶Ⅲ
不同厂商提供的外切核酸酶Ⅲ的质量不同，在大批量制备嵌套缺失模板之前应进行分析性消化检査外切核酸酶Ⅲ的质量。
Klenow 混合物（足以用于 30 个样品）
水 20ul
1mol/LMgCl2 6ul
0.1mol/LTris-Cl 3ul
Klenow 片段 3 单位
临用前在冰上制备以上混合物。
连接混合物（24 个样品）
水 550ul
10x 噬菌体 T4 连接酶缓冲液 100ul
5 mmol/L rATP 100ul
聚乙二醇（30%m/V PEG8000) 250ul
噬菌体 T4DNA 逨接酶 5 单位
临用前在冰上制备以上混合物。
核酸酶 S1 反应混合物
水 172ul
10XS1 缓冲液 27ul
核酸酶 S1 60 单位
临用前制备该混合物
绿豆酶可用来替代以上反应中的核酸酶 S1
限制性内切酶（两种）
有关限制酶的选择以及适当地将其识别位点引入靶 DNA 的讨论，请见本方案前言部分和信息栏中关于外切核酸酶Ⅲ的专栏。
凝胶
1%(m/v) 琼脂糖凝胶（两祌)
核酸和寡核苷酸
靶 DNA
分析靶 DNA 序列中是否存在适当的限制酶位点。将待消化的 DNA 克隆进质粒或噬菌体载体，载体应含尽量少的非必需序列。取一份用作诱变底物的重组质粒 DNA 溶解在 TAE 缓冲液（见第 5 章方案 1) 中. 进行琼脂糖凝胶电泳分析。质粒中超螺旋分子应占 90％ 以上。如果制备的质粒中带有线状分于或 10% 以上的缺口或松弛型质粒，应重新进行纯化。
因为外切核联酶Ⅲ消化从单链缺口处开始，闭合环状分子必须占模板 DNA 制品组成的绝大多数。纯化模扳另外的好处是可以从闭合环状 DNA 制品中除去干扰外切核酸Ⅲ消化的小片段 DNA 和 RNA。
专用设备
微量离心管（0.5 ml) 或带 U-型孔的微量滴定板（例如，Boxter B1190-17)。可预调 30°C、37°C 和 70°C 的水浴装置。
其他试剂
本方案步骤 14 需要的试剂列在第 1 章方案 24、25 或 26(用于转化）。
本方案步骤 15 需要的试剂列在第 1 章方案 1 或 4(用于微量质粒 DNA 制备）或
第 3 章方案 3(制备复制型式的 M13DNA)。
本方案步骤 16 需要的试剂列在第 12 章方案 3、4 或 5 中。
方法
1. 用能消化载体上引物结合区和靶 DNA 之间的多克隆位点的两种限制酶消化 10ug 靶 DNA(重组的噬菌体 M13 复制型 DNA、噬菌粒 DNA 或质粒 DNA)。
为获得最佳酶切效果，避免使用多克隆位点中紧密相邻的限制酶位点。限制酶消化反应应在低 DNA 浓度和生产厂商推荐的合适的酶切缓冲液的大反应体积中进行。先用产生钝端或 3’凹端的酶消化。通过凝胶电泳检査证实所有的闭含环状 DNA 都已经转变成线状 DNA 时，调节缓冲液，加入第二种酶。或者进行常规的酚：氯仿抽提和乙醇沉淀，在适合的缓冲液中进行第二种酶消化。任何逃脱第二种酶消化的 DNA 都将被外切核酸酶Ⅲ从两个方向进行消化，因此不可能产生存活的克隆。第二次酶切的效率可以通过 32P 末端标记第一次的切割位点，检査第二次酶切后放射性丢失 50% 来测定。
如果遇到无法用两种限制酶完全消化模板的困难，我们推荐使用基于 Henikoff(1990) 所建立方法设计的商业化试剂盒。在这一过程中，用单链环状噬菌粒 DNA 作为噬菌体 T4DNA 聚合酶催化寡核苷酸引物延伸反应的模板。该反应在紧接引物 5’端处产生缺口的双链环状分子。外切核酸酶Ⅲ被用来切割以上反应产生的 3’末端，通过单链 DNA 特异性的内切酶（核酸酶 S1 或绿豆核酸酶) 消化暴露出单链 DNA。以上过程产生具有与引物 5'端一致的一套相同末端的线状嵌套的 DNA 片段。这些缺失的分子被重新环化用于转化细胞。该方法的优点是可以从靶 DNA 的任意一点上产生嵌套缺失。酶反应可以按顺序在同一个反应管中进行。因此不需要有机溶剂抽提或沉淀 DNA。
基于 Henikoff(1990) 的方法，几种商业化的用于构建缺失突变体的试剂盒已有出售（请见信息栏中关于定点诱变用商业化试剂盒）。
2. 用常规的酚: 氯仿抽提和乙醇沉淀方法纯化 DNA, 仔细的去除上清液，加入 0.5 ml 70% 的乙醇清 DNA 沉淀。
用乙醇灌洗沉淀物是很重要的步骤，因为钠离子抑制外切核酸酶 III 反应（Hoheisel1993)(请见信息栏关于外切核酸酶Ⅲ）。
3. 在微型离心机上以最高速度和 4°C 温度下离心 2 min, 回收经 70% 的乙醇洗过的 DNA 沉淀物，仔细的除去上淸。将反应管放在工作台上打开盖待所有的乙醇挥发。最后将 DNA 溶解在 60ul1x 外切核酸酶缓冲液中，置于冰上待用。
4. 设置 25 个 0.5 ml 的微量离心管，每个离心管中加入 7.5ul 核酸酶 S1 反应混合物；或使用带 U 型孔的 96 孔微量滴定板中的 25 个孔，每孔加入 7.5ul 核酸酶 S1 反应混合物，放置冰上待用。
5.37°C 孵育步骤 3 制备的 DNA 溶液 5 min。转移 2.5ul 溶液至第 1 个含核酸酶 S1 反应混合物的微量离心管或微量滴定板 U 型孔中。
6. 按每 pmole 凹进 3'末端加入 150 单位外切核酸酶Ⅲ的比例（1 单位的外切核酸酶Ⅲ在 37°C 孵育 30 min 的条件下将产生 1nmole 酸溶性总核苷酸）将外切核酸酶Ⅲ加人到剩余的 DNA 溶液中。轻敲管壁以混合管中的反应物，马上将反应管放回 37°C 水浴。
在上述条件下，外切核酸酶Ⅲ的量是饱和的。大约每分钟可从每个 DNA 分子的钝端或 3'凹端去除 200 个核苷酸。改变连续性反应取样的间隔时间可控制去除核苷酸数量的多少。通常外切核酸酶消化 DNA 效率取决于酶和模板之间的摩尔比。为了保证以相同的速率降解所有的 DNA 模板. 保持同步切割几千碱基的 DNA 片段，在消化反应中外切核酸酶Ⅲ必须以超量存在。
也可以通过改变反应温度控制外切核酸酶消化速率。Henikoff(1987) 估计在 30~40C 溫度条件下，温度相差 2°C 消化速率改变 100 碱基/min。
7. 以 30s 为一间隔时间，从 DNA 溶液中取出 2.5ul 样品加入到含核酸酶 S1 反应混合物的微量离心管或微量滴定板孔中。
8. 当所有样品加完后，将含有核酸酶 S1 和被消化 DNA 的微量离心管或微量滴定板放置在 30°C 保温 30 min。
9. 每个离心管或孔中加入 lul 核酸酶 S1 反应停止混合液，在 70°C 保温 10 min。
加热 70°C 灭活核酸酶 S1 和任何残留的外切核酸酶Ⅲ, 有关这些酶的进一步信息请见第 7 章关于核酸酶 S1 和本章后一部分关于外切核酸酶Ⅲ。
10. 将微量离心管或微量滴定板转移到冰床上，通过凝胶电泳分析每一种样品选择的凝胶浓度应能最大限度的分辨起始 DNA 和小于起始的 DNA2kb 的 DNA 片段。
11. 将含期望大小 DNA 的样品收集在一起，每 10ul 样品中加入 1ulKlenow 混合物，37°C 孵育反应混合物 5 min。
12. 每 10ul 收集的样品中加入 1ul0.5 mmol/L 的 dNTP, 继续在室温孵育 15 min。
最初在步骤 11 中缺乏 dNTP 的悄况下加入 Klenow 酶短哲孵育，使 Klenow 酶发挥 3’外切核酸酶活性去除被消化 DNA 中保留的任何 3’突出末端。
13. 每 10ul 收集的样品中加入 40ulT4 噬菌体连接酶混合物混匀后继续室温孵育 2 h。
14. 取连接的 DNA 转化合适的大肠杆菌宿主菌。
15. 至少从 24 个随机挑选的噬菌斑或克隆中进行小量噬菌体 M13 复制型 DNA、质粒或噬菌粒 DNA 制备。
16. 用合适的限制性内切酶将 DNA 消化成线状分子，用 1% 的琼脂糖凝胶分析它们的分子量大小。用同样被限制酶切成线状的原始质粒或噬菌体 DNA 作为标准参照构。选择大小合适的克隆进一步序列分析（第 12 章）或限制酶图谱分析。
大约 80%~90% 的缺失保留一个通用引物或反向引物结合位点，可利用适当的寡梭苷酸进行测序。为保证能分析一整套序列重叠 DNA, 最好选择分子量大小差别 400 碱基左右的克隆进行测序。请见第 12 章关于怎样用重新连接和转化的 DNA 进行序列分析的方案。
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分清参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。
dNTP 溶液中含有 dATP、dGTP 和 dTTP, 每种 dNTP 浓度为 0.5 mmol/L，溶在 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
乙醇（100%, 冰冷；70%, 室温。)
10x 外切核酸酶Ⅲ缓冲液
660 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
66 mmol/LMgCl2
100 mmol/Lβ-巯基乙醇
核酸酶 S1 停止反应混合液
0.3 mmol/L Tris
50 mmol/L EDTA(pH8-0)
酚：氯仿
醋酸钠（3mol/L,pH5.2)
酶和缓冲液
外切核酸酶Ⅲ
不同厂商提供的外切核酸酶Ⅲ的质量不同，在大批量制备嵌套缺失模板之前应进行分析性消化检査外切核酸酶Ⅲ的质量。
Klenow 混合物（足以用于 30 个样品）
水 20ul
1mol/LMgCl2 6ul
0.1mol/LTris-Cl 3ul
Klenow 片段 3 单位
临用前在冰上制备以上混合物。
连接混合物（24 个样品）
水 550ul
10x 噬菌体 T4 连接酶缓冲液 100ul
5 mmol/L rATP 100ul
聚乙二醇（30%m/V PEG8000) 250ul
噬菌体 T4DNA 逨接酶 5 单位
临用前在冰上制备以上混合物。
核酸酶 S1 反应混合物
水 172ul
10XS1 缓冲液 27ul
核酸酶 S1 60 单位
临用前制备该混合物
绿豆酶可用来替代以上反应中的核酸酶 S1
限制性内切酶（两种）
有关限制酶的选择以及适当地将其识别位点引入靶 DNA 的讨论，请见本方案前言部分和信息栏中关于外切核酸酶Ⅲ的专栏。
凝胶
1%(m/v) 琼脂糖凝胶（两祌)
核酸和寡核苷酸
靶 DNA
分析靶 DNA 序列中是否存在适当的限制酶位点。将待消化的 DNA 克隆进质粒或噬菌体载体，载体应含尽量少的非必需序列。取一份用作诱变底物的重组质粒 DNA 溶解在 TAE 缓冲液（见第 5 章方案 1) 中. 进行琼脂糖凝胶电泳分析。质粒中超螺旋分子应占 90％ 以上。如果制备的质粒中带有线状分于或 10% 以上的缺口或松弛型质粒，应重新进行纯化。
因为外切核联酶Ⅲ消化从单链缺口处开始，闭合环状分子必须占模板 DNA 制品组成的绝大多数。纯化模扳另外的好处是可以从闭合环状 DNA 制品中除去干扰外切核酸Ⅲ消化的小片段 DNA 和 RNA。
专用设备
微量离心管（0.5 ml) 或带 U-型孔的微量滴定板（例如，Boxter B1190-17)。可预调 30°C、37°C 和 70°C 的水浴装置。
其他试剂
本方案步骤 14 需要的试剂列在第 1 章方案 24、25 或 26(用于转化）。
本方案步骤 15 需要的试剂列在第 1 章方案 1 或 4(用于微量质粒 DNA 制备）或
第 3 章方案 3(制备复制型式的 M13DNA)。
本方案步骤 16 需要的试剂列在第 12 章方案 3、4 或 5 中。
方法
1. 用能消化载体上引物结合区和靶 DNA 之间的多克隆位点的两种限制酶消化 10ug 靶 DNA(重组的噬菌体 M13 复制型 DNA、噬菌粒 DNA 或质粒 DNA)。
为获得最佳酶切效果，避免使用多克隆位点中紧密相邻的限制酶位点。限制酶消化反应应在低 DNA 浓度和生产厂商推荐的合适的酶切缓冲液的大反应体积中进行。先用产生钝端或 3’凹端的酶消化。通过凝胶电泳检査证实所有的闭含环状 DNA 都已经转变成线状 DNA 时，调节缓冲液，加入第二种酶。或者进行常规的酚：氯仿抽提和乙醇沉淀，在适合的缓冲液中进行第二种酶消化。任何逃脱第二种酶消化的 DNA 都将被外切核酸酶Ⅲ从两个方向进行消化，因此不可能产生存活的克隆。第二次酶切的效率可以通过 32P 末端标记第一次的切割位点，检査第二次酶切后放射性丢失 50% 来测定。
如果遇到无法用两种限制酶完全消化模板的困难，我们推荐使用基于 Henikoff(1990) 所建立方法设计的商业化试剂盒。在这一过程中，用单链环状噬菌粒 DNA 作为噬菌体 T4DNA 聚合酶催化寡核苷酸引物延伸反应的模板。该反应在紧接引物 5’端处产生缺口的双链环状分子。外切核酸酶Ⅲ被用来切割以上反应产生的 3’末端，通过单链 DNA 特异性的内切酶（核酸酶 S1 或绿豆核酸酶) 消化暴露出单链 DNA。以上过程产生具有与引物 5'端一致的一套相同末端的线状嵌套的 DNA 片段。这些缺失的分子被重新环化用于转化细胞。该方法的优点是可以从靶 DNA 的任意一点上产生嵌套缺失。酶反应可以按顺序在同一个反应管中进行。因此不需要有机溶剂抽提或沉淀 DNA。
基于 Henikoff(1990) 的方法，几种商业化的用于构建缺失突变体的试剂盒已有出售（请见信息栏中关于定点诱变用商业化试剂盒）。
2. 用常规的酚: 氯仿抽提和乙醇沉淀方法纯化 DNA, 仔细的去除上清液，加入 0.5 ml 70% 的乙醇清 DNA 沉淀。
用乙醇灌洗沉淀物是很重要的步骤，因为钠离子抑制外切核酸酶 III 反应（Hoheisel1993)(请见信息栏关于外切核酸酶Ⅲ）。
3. 在微型离心机上以最高速度和 4°C 温度下离心 2 min, 回收经 70% 的乙醇洗过的 DNA 沉淀物，仔细的除去上淸。将反应管放在工作台上打开盖待所有的乙醇挥发。最后将 DNA 溶解在 60ul1x 外切核酸酶缓冲液中，置于冰上待用。
4. 设置 25 个 0.5 ml 的微量离心管，每个离心管中加入 7.5ul 核酸酶 S1 反应混合物；或使用带 U 型孔的 96 孔微量滴定板中的 25 个孔，每孔加入 7.5ul 核酸酶 S1 反应混合物，放置冰上待用。
5.37°C 孵育步骤 3 制备的 DNA 溶液 5 min。转移 2.5ul 溶液至第 1 个含核酸酶 S1 反应混合物的微量离心管或微量滴定板 U 型孔中。
6. 按每 pmole 凹进 3'末端加入 150 单位外切核酸酶Ⅲ的比例（1 单位的外切核酸酶Ⅲ在 37°C 孵育 30 min 的条件下将产生 1nmole 酸溶性总核苷酸）将外切核酸酶Ⅲ加人到剩余的 DNA 溶液中。轻敲管壁以混合管中的反应物，马上将反应管放回 37°C 水浴。
在上述条件下，外切核酸酶Ⅲ的量是饱和的。大约每分钟可从每个 DNA 分子的钝端或 3'凹端去除 200 个核苷酸。改变连续性反应取样的间隔时间可控制去除核苷酸数量的多少。通常外切核酸酶消化 DNA 效率取决于酶和模板之间的摩尔比。为了保证以相同的速率降解所有的 DNA 模板. 保持同步切割几千碱基的 DNA 片段，在消化反应中外切核酸酶Ⅲ必须以超量存在。
也可以通过改变反应温度控制外切核酸酶消化速率。Henikoff(1987) 估计在 30~40C 溫度条件下，温度相差 2°C 消化速率改变 100 碱基/min。
7. 以 30s 为一间隔时间，从 DNA 溶液中取出 2.5ul 样品加入到含核酸酶 S1 反应混合物的微量离心管或微量滴定板孔中。
8. 当所有样品加完后，将含有核酸酶 S1 和被消化 DNA 的微量离心管或微量滴定板放置在 30°C 保温 30 min。
9. 每个离心管或孔中加入 lul 核酸酶 S1 反应停止混合液，在 70°C 保温 10 min。
加热 70°C 灭活核酸酶 S1 和任何残留的外切核酸酶Ⅲ, 有关这些酶的进一步信息请见第 7 章关于核酸酶 S1 和本章后一部分关于外切核酸酶Ⅲ。
10. 将微量离心管或微量滴定板转移到冰床上，通过凝胶电泳分析每一种样品选择的凝胶浓度应能最大限度的分辨起始 DNA 和小于起始的 DNA2kb 的 DNA 片段。
11. 将含期望大小 DNA 的样品收集在一起，每 10ul 样品中加入 1ulKlenow 混合物，37°C 孵育反应混合物 5 min。
12. 每 10ul 收集的样品中加入 1ul0.5 mmol/L 的 dNTP, 继续在室温孵育 15 min。
最初在步骤 11 中缺乏 dNTP 的悄况下加入 Klenow 酶短哲孵育，使 Klenow 酶发挥 3’外切核酸酶活性去除被消化 DNA 中保留的任何 3’突出末端。
13. 每 10ul 收集的样品中加入 40ulT4 噬菌体连接酶混合物混匀后继续室温孵育 2 h。
14. 取连接的 DNA 转化合适的大肠杆菌宿主菌。
15. 至少从 24 个随机挑选的噬菌斑或克隆中进行小量噬菌体 M13 复制型 DNA、质粒或噬菌粒 DNA 制备。
16. 用合适的限制性内切酶将 DNA 消化成线状分子，用 1% 的琼脂糖凝胶分析它们的分子量大小。用同样被限制酶切成线状的原始质粒或噬菌体 DNA 作为标准参照构。选择大小合适的克隆进一步序列分析（第 12 章）或限制酶图谱分析。
大约 80%~90% 的缺失保留一个通用引物或反向引物结合位点，可利用适当的寡梭苷酸进行测序。为保证能分析一整套序列重叠 DNA, 最好选择分子量大小差别 400 碱基左右的克隆进行测序。请见第 12 章关于怎样用重新连接和转化的 DNA 进行序列分析的方案。
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