单链构象多态性和异源双链分析方法检测突变实验

扩增缓冲液 dNTP 混合溶液 甲酰胺上样缓冲液 蔗糖凝胶缓冲液 TBE 电泳缓冲液 限制性内切酶 热稳定 DNA 聚合酶 人类基因组 DNA 正向引物和反向引物 [a-32P]dCTP 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 过硫酸胺 甘油 TEMED
带屏障装置的自动移液器吸头 沸水浴 电泳板、破璃和 0.4 mm 隔条 干胶设备 玻璃毛细管 Hamilton 注射器 微量离心管 可调式移液器 热循环仪 水浴 Whatman3 MM 滤纸

材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。

10x 扩增缓冲液

含 4 种 dNTP, 每种浓度为1mml/L(PH7.0) 的 dNTP 混合溶液（PCR 级）

甲酰胺上样缓冲液

蔗糖凝胶缓冲液（缓冲液类型 I)

10XTBE 电泳缓冲液
用 1X 工作强度的 TBE(89 mmol/L Tris-硼酸盐，2 mmol/L EDTA) 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。1xTBE 浓度能提供必需的缓冲能力。缓冲液的 PH 值一般应为 8.3。通常不需要调节 pH 值，然而当使用实验室新制备的 10XTBE 缓冲液时，应检査 pH 值变化。
用同一种 10XTBE 贮存液制备凝胶和跑胶缓冲液。离子强度和 pH 值的微小变化将产生缓冲液对抗。使 DNA 带型发生极大的扭曲。

酶和缓冲液

限制性内切酶（选用）

热稳定 DNA 聚合酶
推荐使用 Taq DNA 聚合酶

核苷酸和寡核苷酸

用于筛选点突变的人类基因组 DNA
将 DNA 以 10ug/ml 在 TE(pH7.6) 缓冲液中。

寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物（每种浓度为 35umol/L) 溶在 TE 中 (pH7.6)

放射性物质

[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)

凝胶

丙烯酰胺：双丙烯酰胺（29:1;m/V)
许多研究者使用商业化的预制丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液（例如.Acrylogel BDH）。然而，使用 Hydrolink 系列凝胺基质（Molinarif et al.1993) 可获得最好的分辨率，它的商业化名称是 MDE(Mutation Detection Enhancement), 产品是由 FMC 生物制品公同（Rockland,Maine) 制造。

过硫酸胺（10%w/V)

甘油
使用高纯度级别的甘油，例如超纯的（Life Technologies)。请见关于甘油的信息栏。

TEMED(四甲基乙二胺）
许多厂商. 包括 Sigma 公司和 Bio-Rad 公司出售电泳级的 TEMED。TEMED 易吸湿，应贮存在密封的容器中，4°C 温度下保存。
TEMEU 的作用是辅助催化丙烯酰胺聚合。

专用设备

带屏障装置的自动移液器吸头

沸水浴

电泳板、破璃（两块 40 cmX40 cm 的玻璃）和 0.4 mm 隔条。

干胶设备

玻璃毛细管（拉长）或带凝胶上样吸头的微量移液器

Hamilton 注射器或巴斯德移液器

微量离心管（扩增闬 0.5 ml 薄壁管）

可调式移液器

能够按扩增方案设定程序的热循环仪
如果热循环仪不带加热盖装置，使用轻矿物油或石蜡防止 PCR 过程中反应混合物的液体挥发。

限制性内切核酸酶消化所需温度的水浴

Whatman3 MM 滤纸

方法

扩增用于筛选点突变的 DNA

1. 按顺序在一个消毒的离心管中混合下列成分:

1 mmol/LdNTP 溶液                                1ul
10x 扩增缓冲液                                       2ul
35umol/L 5'-寡核苷酸溶液                      1ul
35umol/L 3'-寡核苷酸溶液                      1ul
10uCi/ul[a-32Pld-CTP                             1ul
人的基因组 DNA                                     10ul(100ng)
热稳定 DNA 聚合酶                                 1~3 单位
加水至 20ul

在 PCR 过程中 [a-32P]dCTP 被均勻地结合并标记到扩增的 DNA 中。用 32P 标记的寡核苷酸引物代替 [a-32P〕dCTP 产生末端标记的 DNA。
如果可能，设置二组已知的在等位基闲序列上含有个或多个碱基不同的而且已知在 SSCP 胶上能够分辨出来DNA 样品作为对照。为避免发生污染需另外设置一个不加模板 DNA 的阴性对照

2. 如果热循环仪不带加热盖装置，加入 1 滴（约 50ul) 轻矿物油覆盖反应混合物以防止在反复加热和冷却循环过程中样品蒸发。若使用热启动程序，可在管中加入一滴石蜡油。将反应管置于热循环仪中。

3. 按下列表中列出的变性、退火、聚合时间和温度进行扩增。热循环参数的设定请参考第 8 章方案 I。
上述反应条件适合于 50ul 反应体积、0.5 ml 薄壁管和 Perkin-Elmer9600、9700 ，Master Cyder(Eppendorf) 或PTC100(MJ Research) 热循环仪。使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。

制备 SSCP 凝胶

4. 当开始 PCR 反应时，用含 10%(V/V) 甘油的 lxTBE 缓冲液制备 5.5% 的聚丙烯酰胺凝胶。

10XTBE 凝胶缓冲液                                              10 ml
29:1 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺溶液                             18 ml
10% 过硫酸胺                                                         0.5 ml
甘油                                                                        10 ml
加水至                                                                    61.5 ml
溫和搅动以混合以上试剂。

上述体积的溶液足够灌制一块标准大小（40 cmX40 cm）垫片厚度为 0.4 mm 的凝胶。可增加或降低凝胶溶液体积制备所需大小的凝胶。
用相同的 10XTBE 贮存液制备足以填满凝胶电泳装置的 1XTBE 凝胶缓冲液。

5. 把两快 40 cmX40 cm 玻璃电泳板和 0.4 mm 垫片装配并沾合在一起。
为了获得单链 DNA 构象异构体的最大分辨率，应使用凝胶厚度等于或小于 0.4 mm 的垫片。

6. 加入 100ul TEMED 溶液，温和摇晃三角瓶，混合溶液并灌制凝胶。
丙烯酰胺溶液聚合速度很快，因此操作要迅速，灌制薄胶的方法请见第 12 章方案 8。

7. 室温下把已经聚合的凝胶放到电泳装置中。电泳糟中加满与制备凝胶缓冲液相同的1XTBE 缓冲液。

制备 SSCP 电泳样品

8.(可做可不做）当 PCR 反应结束时取出反应管置于冰上，若扩增 DNA 片段需要用限制酶消化，设置下列酶切反应

PCR 溶液                                                          5ul
限制性缓冲液                                                    4ul
限制性内切酶 (2~50 单位）                              2ul
水                                                                      29ul
在适合限制酶消化的溫度下孵育 1~2 h。



9. 用蔗糖凝胶上样缓冲液将 1.5ul 原始 PCR 产物（步骤 3) 或 5ul 限制酶消化的 PCR 产物（步骤 8) 稀释至 20ul。用甲酰胺染料混合物将相同量的样品稀释至 20ul。

用甲酰胺染料混合物稀释的样品将被变性，而用蔗糖凝胶缓冲液稀释的样品保持双链用作对照。

10. 将含甲酰胺的样品煮沸 6 min, 然后直接把反应管插入冰中。

SSCP 凝胶电泳分离和分析 DNA 片段

11. 使用巴斯德滴管或汉密尔顿注射器吸取 1XTBE 缓冲液冲洗聚丙烯酰胺凝胶的加样孔。用一个拉长的玻璃毛细管或带有凝胶上样吸头的微量移液器分別取 2ul 样品加到聚丙烯酰胺凝胶电泳上。

12, 使用电压为 6~7V/cm[约 250V(和 15mA) 对于 40 cmX40 cm 凝胶]，电泳 14 h。

13. 电泳完成后，分离玻璃板，将凝胶转移至 1 层 Whatman3 MM 滤纸上，真空干燥30~60 min。

14. 对干凝胶进行放射自显影，在无增感屏的情况下室温曝光 4~16 h。

非变性 PCR 样品（即，用蔗糖凝胶上样缓冲液稀释的样品）以双链 DNA 的形式在凝胶中迁移。相比之下，变性样品（即与甲酰胺染料混合物混合并进行煮沸的样品）将以双链和单链混合物的形式在凝胶中迁移。单链 DNA 通常在丙烯酰胺凝胶中的迁移率低于双链分子（Majwm and Gilbert 1977，1980;Szalay et al.1977)。在两条 DNA 互补链折叠形成的抅型不能被 SSCP 分辨的情况下，有-条单链条带能被检测到。如果互补链折叠成可以分辨的构型. 两条链都能被检测到。二倍体生物的杂合等位基因的 PCK 产物产生至少 4 条带，两条带与野生型迁移率相同，另外两条带为特异的突变体。然而、往往会出现多于两条带的情况，既可能是样品遗传非均一性的结果，也可能是由于同一 DNA 分子的两条互补链自身折叠形成了多于一种形态的构象。带型相当复杂，而且很难从 DNA 序列、碱基组成和片段的长度来推算。然而，对于一种特定的诱变通常会有一种具有特征的带型。