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DNA实验

大量细菌克隆的杂交方法筛选实验

2024-06-04 DNA实验 加入收藏
原理这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道,主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的


原理

这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道,主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的 cDNA 文库直接置于不含洗涤剂的硝酸纤维素膜或尼龙膜上,复制膜用膜-膜接触的方法制备。采用这一方法,每块 150 mm 板上的 2X104 克隆或每块 90 mm 板上的 1X104 克隆可以被复制,并作进一步杂交筛选。

材料与仪器

重组质粒转化的 E.coli
LB 或 SOB 琼脂板 平头镊子 18 号针头 硝酸纤维素膜 注射器 Whatman 3 MM 圆形滤纸

步骤

一、材料

1. 培养基

(1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。

本方案中使用 2~3 天旧板效果最好,因为旧板更容易吸收接种物中的水分。

(2) 含有适当抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板。

(3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。

氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。

2. 专用设备

平头镊子(如 Millipore 镊子)

18 号针头

硝酸纤维素膜(Millipore HATF,或相当产品)或尼龙膜,无菌无去污剂污染

注射器(3 cc)

Whatman 3 MM 圆形滤纸。(提前准备一叠 Whatman 3 MM 滤纸(毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠,还要加一些备用品),并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸,高温高压消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm2) 10 min ]。

3. 载体和菌种

重组质粒转化的 E.coli,用作培养物。



扩增的 cDNA 文库,生长为培养物。

二、方法

1. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记,用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间,用铝箔松散地包好,液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm2) 10 min]。

准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜,但如果不再从主板制备备份,未消毒的滤膜也可以用。

2. 用平头镊子将一张消过毒的滤膜,标记面向下,置于含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板已制备 2~3 天,滤膜完全浸湿后,将其从板上揭下,翻过来标记面向上,再置于琼脂板表面。

3. 将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心,用一个无菌玻璃棒使菌液分散,在滤膜四周留出 2~3 mm 宽的无菌区。

大滤膜(直径 137 mm)可提供 0.5 ml 细菌悬液,含 2X104 个活菌;小滤膜(直径 82 mm) 提供 0.2 ml 细菌悬液,含 ~104 个活菌。

4. 将琼脂板的盖半开(不要倒置)置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发,盖上盖子,颠倒琼脂板于 37℃ 培养直至出现直径 0.1~0.2 mm 的小菌落(约 8~10 h)。

5. 如需要,可在此时按步骤 6 制备备份滤膜,否则按以下步骤使菌落可冻存于 -20℃:

(1) 将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板表面。

(2) 于 37℃ 培养 2 h。

如进行 cDNA 文库筛选,最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主滤膜可在 4℃ 保存 2 周。

(3) 用 Parafilm 膜封好琼脂板,颠倒置于封闭的塑料袋的于 -20℃ 保存。

于室温使主板(仍以颠倒位置 ) 解冻后即可制作备份。

6. 将主膜(硝酸纤维膜或尼龙膜)菌落面上置于无菌的 Whatman 3 MM 滤纸上。

7. 标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜,置于主膜上,防治在两膜之间形成气泡。

最好将第二张滤膜稍微卷曲,以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触,就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠,以便于以后使两者分离。

8. 在滤膜上再盖一张圆形 3 MM 滤纸,并在滤纸上放一个培养皿,用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。

9. 拿掉培养皿和顶层 3 MM 滤纸,用连接注射器的 18 号针头在双层滤膜作一些空,以作标记方位。

确保针头剌穿两层滤膜。

10. 使两膜分开,将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板。

此时,可按步制备第二张备份,用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。

11. 将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB) 琼脂板,于 37℃ 培养,直到长出菌落(4~6 h)。

12. 这一阶段,当细菌生长依然很快,滤膜可以转到含有氯霉素的(170~200 μg/ml) 的(或 SOB ) 琼脂板,于 37℃ 培养 12 h。

13. 将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 琼脂板,而后按步骤 5 冻存。

14. 裂解附着于备份膜上菌落,将释放出的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。


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