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DNA实验

区域特异性诱变

2024-06-08 DNA实验 加入收藏
原理可在长达3‘的克隆化DNA片段上产生大量的随机分布的核苷酸替换突变,在将DNA克隆到一个可用来分离单链DNA的载体后,用各种可造成特定碱基损伤的化学试剂处理


原理

可在长达3‘的克隆化DNA片段上产生大量的随机分布的核苷酸替换突变,在将DNA克隆到一个可用来分离单链DNA的载体后,用各种可造成特定碱基损伤的化学试剂处理。

材料与仪器

DNA
乙酸钠 亚硝酸钠 TE 无水乙醇 dNTP 反转录酶 RNA酶 洗脱液 溴化乙锭
水浴锅 培养箱

步骤

1.  用限制性内切核酸酶消化DNA以获得目的DNA片段,将靶片段双向克隆到M13噬菌体载体或含有M13复制起始子的质粒载体中。从100 ml 感染细抱培养物中提取单链DNA。

2.  在三个微量离心管内各加入40 ug 1 mg/ml 的单链DNA,如果靶序列的两条链都要被利用,则需用6个反应。
 
3.  亚硝酸反应:在一个管内加入10 ul pH4.3的2.5 mol/l 乙酸钠和50 ul 2 mol/l 亚硝酸钠,混匀,室温温育60 min。

4.  甲酸反应:在另一管内加60 ul 浓甲酸,混匀,室温温育10 min。

5.  肼反应:在第三个管内加60 ul 浓肼,混匀,室温温育10 min。

6.  毎管加100 ul 2.5 mol/l pH5.5的乙酸钠,30 ug 担体tRNA和1 ml 无水乙醇,置干冰中冻至-80℃,放置10 min,离心10 min,去上清,重复乙醇沉淀两次,再用80 ul TE缓冲液重悬DNA。

7.  在重悬的DNA内加10 ul 4种dNTP混合液,10 ul 10x反转录酶缓沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃温育5 min,再于40℃温育15 min。

8.  加10 ul 4种dNTP混合液和30~40 U 的AMV反转录酶,37℃温育1 h。

9.  用缓冲液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA,DNA重悬于100 ul  10x限制性内切酶缓冲液,并用适当的限制性内切酶切割,以便从载体中回收片段。

10.  酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重悬于10~15 ul 洗脱缓冲液,并加0.5 ul 2 mg/ml RNA酶A,37℃温育15 min 以降解担体tRNA。
 
11.  在非变性的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳上,分离从载体上切下的目的片段,凝胶用溴化乙锭染色,切胶,洗脱出DNA。

12.  将纯化的插入DNA连接到具有互补末端的质粒或细菌噬菌体载体中。通过常规的转化程序将连接混合物导入合适的细菌中。

注意事项

由于不同的化学诱变剂性能差别很大,在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析,同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解,这样才能保证使用的有效性和人体安全性。

常见问题

1. 由于不同的化学诱变剂性能差别很大,在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析,同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解,这样才能保证使用的有效性和人体安全性。


2. 当筛选方法可信度高时,往往检测方法是比较繁琐的(尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型)这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度,减少筛选的繁琐程度,而在复筛中进一步加以确定。



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