酶切片断的脱磷实验基本方案

1.  在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入

（1）10×碱性磷酸酶缓冲液  10 μl

（2）碱性磷酸酶（0.01 u/pmol ends）  1-2 ul

（3）ddH2O到100 ul

（4）对于5‘突出则37℃下温浴30分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴30分钟。

（5）对于平末端或3’突出末端，则37℃下温浴15分钟，56℃下温浴15分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴15分钟。56℃下温浴15分钟。

2.  温浴结束后加入EDTA（pH8.0）至终浓度分别为10 mM，65℃加热20 min，以灭活碱性磷酸酶。

3.  用酚、氯仿各抽提一次。

4.  加入1/2体积NH4AC，充分混匀，再加入2体积的乙醇，-20℃放置2 hr（或-70℃30分钟），12 000 g 离心10分钟，沉淀DNA。

5.  冷70%乙醇洗沉淀一次。

6.  TE溶解（终浓度为100 μg/μl），-20℃保存。