粘粒及质粒文库的铺平板和转移实验基本方案
材料与仪器质粒LB NaOH 氯霉素 Tris·Cl NaCl硝酸纤维素滤膜 离心机 布氏漏斗 培养箱步骤1. 在含抗生素的平板上，通过系列等比稀释确定质粒和
材料与仪器
质粒
LB NaOH 氯霉素 Tris·Cl NaCl
硝酸纤维素滤膜 离心机 布氏漏斗 培养箱
LB NaOH 氯霉素 Tris·Cl NaCl
硝酸纤维素滤膜 离心机 布氏漏斗 培养箱
步骤
1. 在含抗生素的平板上，通过系列等比稀释确定质粒和粘粒文库的滴度，计算出最佳的铺平板用的细菌悬液量并稀释到5~10 ml LB培奍基中。
12. 将滤膜转栘到含50 μg/ml 氯霉素的LB平板上，37s℃培养4~10 h，以扩增粘粒和质粒。
2. 准备一层无菌的10 cm 或15 cm的Whatman 3 MM 滤纸，故在玻璃布氏漏斗或瓷质过滤漏斗中，加入10~20 ml LB培养基。
3. 将标记好方向的硝酸纤维素滤膜放入含抗生素的LB平板中，并移至过滤装置，再将细菌悬液用吸管加到滤膜上，注意不要往滤膜边缘4~5 mm 处加液体。
3. 将标记好方向的硝酸纤维素滤膜放入含抗生素的LB平板中，并移至过滤装置，再将细菌悬液用吸管加到滤膜上，注意不要往滤膜边缘4~5 mm 处加液体。
4. 慢慢抽吸液体，待菌悬液被吸干之后，揭下滤膜并移至含抗生素的平板中，置于37℃培养，直至长出直径达1~2 mm 的菌落。
5. 标记并浸湿另一张硝酸纤维素滤膜。
6. 先将长有克隆的滤膜（细菌面朝上）放在几张20 cm×20 cm Whatman 3MM 滤纸上。
7. 戴上手套把浸湿的硝酸纤维素滤膜按标记好的位置覆盖到长有细菌的膜上，膜于膜之间最好错开2~3 mm，以便于滤膜之间的分离。
5. 标记并浸湿另一张硝酸纤维素滤膜。
6. 先将长有克隆的滤膜（细菌面朝上）放在几张20 cm×20 cm Whatman 3MM 滤纸上。
7. 戴上手套把浸湿的硝酸纤维素滤膜按标记好的位置覆盖到长有细菌的膜上，膜于膜之间最好错开2~3 mm，以便于滤膜之间的分离。
8. 在硝酸纤维素膜上覆盖3张20 cm×20 cm 的3 MM 滤纸，并同样大小的玻璃平板压在其上，转印克隆。
9. 移去压在滤膜上的玻璃平板和滤纸，用20-G针头在重叠的原滤膜和转印膜上刺一小孔以标记方向。
10. 然后将它们分开，有菌落的一面朝上分别放入琼脂平板中过夜生长，转印膜 于37℃培养，原滤膜则于25℃培养。
11. 主琼脂平板保存于4 ℃，或继续进行转印实验。
10. 然后将它们分开，有菌落的一面朝上分别放入琼脂平板中过夜生长，转印膜 于37℃培养，原滤膜则于25℃培养。
11. 主琼脂平板保存于4 ℃，或继续进行转印实验。
12. 将滤膜转栘到含50 μg/ml 氯霉素的LB平板上，37s℃培养4~10 h，以扩增粘粒和质粒。
13. 接着，滤膜转印面朝上，依次放在3张分别饱蘸下面3种液体的46 cm×75 cm 3MM Whatman滤纸上5 min。
（1）0.5 mol/l NaOH
（2）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
（3）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5 / 1.25 mol/l NaCl
14. 用3 MM 滤纸将滤膜吸干后于80℃真空烤炉干烤90 min。
15. 采用切口平移标记的探针与滤膜作杂交实验。
（1）0.5 mol/l NaOH
（2）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
（3）1 mol/l Tris·Cl，pH7.5 / 1.25 mol/l NaCl
14. 用3 MM 滤纸将滤膜吸干后于80℃真空烤炉干烤90 min。
15. 采用切口平移标记的探针与滤膜作杂交实验。
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