变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50-60 ℃，变性剂0-100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

2. 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30-40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

3.  作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100-500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3.垂直变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0-100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。

PCR产物加上样缓冲液后上样，300-400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2-4小时。

4.平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。

PCR产物加上样缓冲液后，25μl-30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3-6小时。

5.染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。

2.  有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效。

3. 电泳时凝胶温度必须保持恒定，要达到这一要求，可把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行（但温度稍高或低一点都可采用）。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可。

4.该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。

一、实验过程中的操作细节：

1. 点样的时候最好用微量进样器，避免污染和样品漂浮。

2. 为避免边缘效应，两边可以一定点一些样品。

3. 制胶是关键。玻璃板一定要洗干净，在灌胶时，要匀速的转动滑轮，将凝胶液匀速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。

二、实验结果的评估

DGGE图谱很模糊，只有很少的几个条带，可能是因为变性胶浓度不合适而导致产物结果无法完全呈现在图谱上。除此外，也可能是因为样品量过低而导致图谱模糊。在实验过程中中，操作过程、胶的均匀程度、玻璃板的洁净程度等都会影响电泳的结果。