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DNA实验

膜印记杂交法（固相杂交-斑点/狭缝印迹杂交法）

2024-05-18 DNA实验加入收藏

简介斑点印迹杂交法（dot blotting）是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交；狭缝印记杂交（slot

简介

斑点印迹杂交法（dot blotting）是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交；狭缝印记杂交（slot blotting）采用狭缝点样器加样后杂交，二者的区别主要是点样的形状不同。

原理

斑点/狭缝印迹杂交法的基本原理是将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交。

用途

斑点/狭缝印迹杂交法常用于基因表达的定性及定量分析，是实验室中的常用技术。

材料与仪器

试剂：

去离子甲酰胺甲醛（37%) 20XSSC NaOH 预杂交液

仪器：

狭槽点样器真空泵可烫封塑料袋或杂交管硝酸纤维 K 膜或尼龙膜 Whatman3MJV1 滤纸

步骤

斑点/狭缝印迹杂交法的基本过程可分为如下几步：

(一）样品处理

将 l0ulRNA10ug，（RNA可多至50ug)水溶液与下述溶液混合：

100%甲酰胺 20ul、甲醛（37%) 7ul、20XSSC 2ul

于 60℃ 温育 15min 使其变性，冰浴冷却样品。

(二）点样

用 0.lmol/LNaOH 清洗点样器，再用 DEPC 水充分冲洗。将一张经 20XSSC 浸润的 Whatman 3MM 滤纸铺在点样器上，上面铺张经 20XSSC 浸润 30min 的硝酸纤维素膜，加盖并夹紧，接通真空泵。用 10XSSC 清洗各样孔。在每一 RNA 样品中加 2 倍体积的 20XSSC，混合后加样。于外围几个孔中加染料定位，缓慢抽吸，毎孔用 lml10XSSC 淸洗2次。继续抽吸 5min，吸干滤膜。

(三)固定

取出滤膜，室温晾干后，夹在 2 张 Whatman 3MM 滤纸中间，80℃ 干烤 2h 以固定 RNA

(四）预杂交

滤膜烘干后放入可烫封塑料袋(或杂交管）中，加入 20〜30ml 预杂交液，密封塑料袋后在 42°C 预杂交 3h

(五）探针制备及标记

(六）杂交

将已标记的探针煮沸变性 l0min，取出后立即置冰浴 10min(单链探针不需要变性），将变性探针加入预杂交液中，密封杂交塑料袋后在 42℃ 杂交过夜。

(七）洗膜

杂交结束后，分別用下列洗液洗膜：

1)2XSSC，0.5%SDS，室温洗膜 5min。

2)1XSSC，0.1%SDS，42℃ 洗膜 30min。0.1XSSC，0.5%SDS，56℃ 洗膜 30min。

(八）检测

用 X 射线片进行放射性自显影，附加增感屏，-70°C 曝光 7-10 天。

注意事项

1、使用快速制备法获得的细胞总 RNA 有可能污染基因组 DNA,因此难以用分光光度计来精确测定 RNA 含量。此外还必须防止上样矫作物的出现。对半定最分析来说，每一样品须做两次狭缝印迹，一张膜与所要检测的 RNA 探针杂交，另一张则与另-种 RNA 探针杂交，这种在各个样品中的表达都应一样，或者也可以对一个样品制作-次印迹，但同一张膜必须进行两次重复杂交。

2、RNA 样品在点样时要稀释 8 倍，因此样品的浓度至少为 10mg/mL

3、狭缝杂交很容易出现假阳性性信号。这可通过以下手段尽可能的避免：

①用 Northern 印迹方法严格鉴定探针的特异性；

②在所用测试中均需要有适当的阴性对照；

③须非常细心地制备所用探针、溶液、RNA 等以避免污染。