瞬时转染分析研究的步骤

1．瞬时转染分析法

目前有很多功能性分析方法用于研究转录调控，最常用的方法是瞬时转染分析法。该方法是通过一定的转染程序将含目的调控区的质粒导人培养细胞。在典型情况下，调控区调控“报告基因”的转录。报告基因是在mRNA和蛋白质的水平上都易于被正确检测到的基因 。产生的质粒在培养细胞中转录后，在特定时刻测定从报告基因上合成的mRNA或蛋白质，以评价调控区的活性。人们将这种分析方法称为瞬时转染分析，因为此时质粒仍然以附加的形式存在，很少整合进宿主基因组。因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间内(1～3天)进行测定，否则随着细胞的生长和分裂，质粒会被降解或稀释。虽然瞬时转染分析法具有多种局限性，但该方法仍然常用于对顺式作用DNA序列和调控基因表达的反式因子进行初步分析。

瞬时转染分析法快捷、简单，易于对结果定量，因此成为启动子功能分析的首选方法。

瞬时转染分析法也有两个主要局限性：首先在被转染的细胞中，质粒的人工构象和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能；其次，瞬时转染分析法不能用于检测那些需诱导或分化时间超过48～72小时时间期限的研究。

2．稳定转染分析法

对在瞬时转染分析中未表现出预期活性的调控区，或依赖于特异染色质结构的调控区，可以采用稳定转染分析法，即将含有报告基因的目的基因调控质粒稳定地整合进基因组。此外，还需将由组成型启动子控制的抗药性基因(如显性选择标记基因)稳定地整合进基因组进行分析。抗药性基因可以和报告基因在同一个质粒上，也可以在不同质粒上。将含有报告基因和抗药性基因的质粒转染培养细胞，培养基中加入能杀死不稳定表达抗药性基因细胞的药物，部分质粒被稳定地整合到染色体上。多数情况下，在细胞中多个质粒分子彼此相连形成多联体，多联体随机整合到多联体基因组中，因此每个被稳定转染的细胞都具有独特的整合位点。然后通过测定被稳定转染细胞中报道基因的活性，来确定目的调控区的活性。

稳定转染分析方法的主要优点是，进行分析的调控区及报道基因通常位于近乎天然的染色质构象中，具有近乎天然的拷贝数，这些特点使调控区能更精确地模拟正常功能。在稳定转染分析中，因对转染的细胞进行了选择性扩增，所以克服子瞬转细胞吸收DNA少的缺点。稳定转染分析的另一个特点是对随后的转录分析没有时间限制。因此，稳定转染对所需时间相对较长的研究非常有用。稳定转染分析的缺点是因为要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度较大，需要的时间较长。

3．体外转录分析法

体外转录分析法适用于难以转染的细胞、在转染分析中不能产生具有可检测活性的启动子或进行基因调控更高级研究。该分析方法的一个显著特点是不需要确定有效的转染条件，而且可以在体外反应体系中加入抗体，加入或去除某些转录因子，以评价特定转录因子的功能。

4．转基因分析法

转基因分析法是将报告基因和目的调控区稳定地随机整合到动物基因组中，以检测天然的前后序列中调控区的精确活性。该分析方法能用于确认转染分析中鉴定的特定调控区或调控元件。

5．同源重组分析法

同源重组分析法很少用，仅在培养细胞或动物基因组中对内源基因进行操作。