大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法

摘要： 本文主要介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法.

第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的 培养基 上,在37°C下过夜培养

2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用

3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮 细胞 用

第二天 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升摇瓶

5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时

6. 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）

7. 当OD600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）

8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液（如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）

9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升）,然后加水稀释至离心管的2/3体积.

10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞

12. 离心,弃上清液

13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞

14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）

15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml

16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存

转化方法： 1. 在冰上解冻电 感受态细胞 添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟

3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中

4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT

5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上）

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中

7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原

8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养