用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

1. 从37℃培养16~20 h 的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1 ml 新鲜的16~20 h过夜培养物，转到一个含有100ml LB培养基的1 L 或500 ml 培养瓶中。于37℃振摇培养约2~3 h（旋转摇床200~300 r/min），每隔20~30 min测量OD600值≈0.4。

2. 在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50 ml 聚丙烯离心管中，冰上放置10~20 min。

3. 于4℃4000转 /分离心10 min，回收细菌细胞。

4. 将管倒置1 min，以使最后残留的痕量培养液流尽。

5. 以10 ml 用冰预冷的0.1 mM CaCl2重悬每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000转 /分离心10 min，回收细菌细胞。

6. 每50 ml 初始培养物用2 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

7. 用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200 μl 转移到无菌的微量离心管中，加DNA或连接反应混合物（体积≤10 μl，DNA≤50 ng），轻旋以混匀内容物，冰浴30 min。

8. 将离心管放到预加温到42℃的水浴中，90 s。

9. 将混合物快速转移到冰浴中，冷却1~2分钟，加入适当的培养基在37 ℃培养45 分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因。

10. 将适当体积（每个90 mm平板可达200 μl）已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上。

11. 将平板置于室温至液体被吸收 ，倒置平板于37℃培养箱中，12~16 h，平板培养，克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。