核糖核酸酶保护分析

一、体外转录

在无菌1.5 ml 微型离心管中，结合以下内容：

4 ul 5倍转录缓冲液

2 ul 0.1 M DTT

4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G）

0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ul）RNA酶抑制剂（Promega）中 100 UM冷UTP

1 ul/ug UL线性DNA模板

5 ul 10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol）

1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3

总体积〜20 ul。

孵育1小时，37℃。

2 ul 每个转录的DNA酶I，孵育20分钟， 37℃。

二、探头净化

净化探头使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱（G50葡聚糖凝胶）。检查1 ul 在闪烁计数器，P32通道。一个很好的探头将5×105~1×106 CPM。

三、杂交

打开heatblock到95C。对于在水或乙醇中的样品，干燥适当的RNA量，并包括一个管与1 ul tRNA或糖原（Sigma公司），这是作为阴性对照。

每个样品应具有以下：

24 ul 甲酰胺

2 ul 0.6 M管

2.4 ul 5 M氯化钠

0.3 ul 0.1 M EDTA

2×105 cpm探针

5×104 cpm加载控制探针 DEPC水

总体积30ul

以及混合样品。加热95℃，10分钟。孵育4小时， 55°C。

四、RNase消化

核糖核酸酶消化缓冲液：

300 MM 醋酸钠

10 mM 的TRIS

5 mM EDTA

每个样品添加350 ul 消化缓冲液。

1 ul 4 mg/ml 核糖核酸酶A和0.4 ul 10 u/ul 核糖核酸酶T1。

孵育，30℃，45分钟至1小时。

五、蛋白酶K

向每个样品中添加20%SDS和2.5 ul 的10 mg/ml 的蛋白酶K孵育，37℃ 10 μl 的15-20分钟。

六：清理

提取一次400 ul 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

将上清转移到新的试管中。加入1000 ul 的100%乙醇和1 μl 为10 mg/ml 的糖原。拌匀。

在-70℃，30分钟或在干冰/ ETOH浴中10分钟孵育样品。

旋转的离心15分钟。吸EtOH。让小球在空气中晾干。

重悬在8 ul 甲酰胺的装载染料。允许坐在RT 5-10分钟，经常搅拌。

七：聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

热样品5分钟，100℃。加载到5%polyacrylamide/7 M尿素变性凝胶2000 cpm 的分子量标记物。运行凝胶38-42mA。干凝胶，暴露于膜O / N在-70C增感屏。