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DNA实验

大鼠羟基自由基(HO・)酶联免疫分析

2024-09-25 DNA实验 加入收藏
大鼠羟基自由基(HO ・)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定大鼠血清,血浆,细胞上清及相关液体样本中羟基自由

大鼠羟基自由基(HO ・)酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用         目的:本试剂盒用于测定大鼠血清,血浆,细胞上清及相关液体样本中羟基自由基(HO ・)的含量。

实验原理:

   本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠羟基自由基( HO ・)水平。用纯化的大鼠羟基自由基( HO ・)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入羟基自由基( HO ・),再与 HRP 标记的羟基自由基( HO ・)抗体结合,形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的羟基自由基( HO ・) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值),通过标准曲线计算样品中大鼠羟基自由基( HO ・)浓度。

 

试剂盒组成 

试剂盒组成

48 孔配置

96 孔配置

保存

说明书

1 份

1 份


封板膜

2 片( 48 )

2 片( 96 )


密封袋

1 个

1 个


酶标包被板

1 × 48

1 × 96

2-8 ℃保存

标准品: 90ng/L

0.5ml × 1 瓶

0.5ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

标准品稀释液

1.5ml × 1 瓶

1.5ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

酶标试剂

3 ml × 1 瓶

6 ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

样品稀释液

3 ml × 1 瓶

6 ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

显色剂 A 液

3 ml × 1 瓶

6 ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

显色剂 B 液

3 ml × 1 瓶

6 ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

终止液

3ml × 1 瓶

6ml × 1 瓶

2-8 ℃保存

浓缩洗涤液

( 20ml × 20 倍)× 1 瓶

( 20ml × 30 倍)× 1 瓶

2-8 ℃保存

 

样本处理及要求 

1. 血清:室温血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS , PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS ( PH7.4 ),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可 将标本放于 -20 ℃保存,但 应避免反复冻融 .

7. 不能检测含NaN3的样品 ,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP )活性。

 

操作步骤:

1.         标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品 100μl ,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl ,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl ,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉,再各取 50μl 分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl ,混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl ,混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50μl ,浓度分别为 60 ng/L,40ng/L ,20 ng/L,10ng/L,5 ng/L ) 。

2.         加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、 待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ,然后再加待测样品 10 μ l (样品最终稀释度为 5 倍)。 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3.         温育:用封板膜封板后置 37 ℃温育3 0 分钟。

4.         配液:将 30 ( 48T 的 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 ( 48T 的 20 倍)倍稀释后备用。

5.         洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。

6.         加酶:每孔加入酶标试剂 50μl ,空白孔除外。

7.         温育:操作同 3 。

8.         洗涤:操作同 5 。


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