大鼠羟基自由基（HO・）酶联免疫分析

大鼠羟基自由基（HO ・）酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用         目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中羟基自由基（HO ・）的含量。

实验原理：

   本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠羟基自由基（ HO ・）水平。用纯化的大鼠羟基自由基（ HO ・）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入羟基自由基（ HO ・），再与 HRP 标记的羟基自由基（ HO ・）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的羟基自由基（ HO ・） 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠羟基自由基（ HO ・）浓度。

试剂盒组成 ：

样本处理及要求 ：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃保存，但 应避免反复冻融 .

7. 不能检测含NaN3的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步骤：

1.         标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100μl ，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl ，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl ，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl ，混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl ，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl ，浓度分别为 60 ng/L,40ng/L ,20 ng/L,10ng/L,5 ng/L ） 。

2.         加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、 待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ，然后再加待测样品 10 μ l （样品最终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.         温育：用封板膜封板后置 37 ℃温育3 0 分钟。

4.         配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5.         洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。

7.         温育：操作同 3 。

8.         洗涤：操作同 5 。