CLSI推荐的需氧菌耐药表型及基因型药敏试验方法的应用

作者：中国人民解放军总医院 微生物科——罗燕萍

如果实验室不能通过确认该微生物而预测其药物敏感性，抗生素敏感性则是对引起感染的微生物进行抗生素化疗的有效指征。敏感性试验常可用来判断该病原体属于某一种对几种常用抗生素具有耐药性的细菌。

实验室可以用多种方法来衡量体外细菌对抗菌药物的敏感性。在许多临床微生物实验室，琼脂纸片扩散法常规用来检测常见、生长迅速和一些苛氧的细菌病原体。临床和实验室标准协会（CLSI）文件M02-A11——抗菌药物敏感试验纸片法执行标准，包括了一系列规范纸片扩散法的程序。现有CLSI推荐需氧菌耐药表型总结如下：

CLSI推荐的需氧菌耐药表型

革兰阳性菌耐药表型分为葡萄球菌属、肠球菌属、肺炎链球菌属三大类。葡萄球菌属包括青霉素耐药和ß-内酰胺酶、甲氧西林/苯唑西林耐药、万古霉素的耐药性，诱导性克林霉素的耐药；肠球菌属为青霉素/氨苄西林耐药、万古霉素抗药、高水平氨基糖苷耐药；肺炎链球菌有青霉素和第三代头孢菌素耐药。

革兰阴性菌耐药表型包含超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶、碳青霉烯酶。

CLSI推荐预测基因型药敏试验方法

革兰阳性菌耐药表型检测方法

革兰阳性菌耐药表型分为葡萄球菌属、肠球菌属、肺炎链球菌属三大类。

1. 葡萄球菌属

检测包括青霉素耐药和ß-内酰胺酶、甲氧西林/苯唑西林耐药、万古霉素的耐药性，诱导性克林霉素的耐药。

1.1 青霉素耐药和ß-内酰胺酶

用青霉素检测青霉素酶不稳定青霉素类（氨苄西林、阿莫西林、阿洛西林、羧苄西林、美洛西林、哌拉西林和替卡西林）的敏感性；一些产β-内酰胺酶的葡萄球菌在药敏试验中对青霉素敏感，因此在报告葡萄球菌对青霉素敏感前，应对青霉素的MIC≤0.12ug/ml或抑菌圈直径≥29mm的菌株做β-内酰胺酶测试。

ß-内酰胺酶检测方法：硝噻酚实验和青霉素纸片抑菌环边缘实验。硝噻酚实验适用于葡萄球菌，青霉素纸片抑菌环边缘试验只用于金黄色葡萄球菌的检测。

检测金黄色葡萄球菌是否产生ß-内酰胺酶，青霉素纸片抑菌环边缘试验比硝噻酚实验试验敏感，如果硝噻酚实验为阴性，建议使用对青霉素纸片抑菌环边缘进行评估实验进一步检测，保证青霉素治疗有效性。

1.2 甲氧西林/苯唑西林耐药

对青霉素酶稳定的青霉素类耐药称为耐甲氧西林（例如，甲氧西林、萘夫西林和苯唑西林）。因此，即使甲氧西林已不再用于药敏试验和治疗，缩写字母MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）或MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）仍广为使用。

1.2.1 菌群 对甲氧西林/苯唑西林耐药的菌群包括金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌和其他凝固酶阴性葡萄球菌。路邓葡萄球菌确定对甲氧西林/苯唑西林耐药时被划规至金黄色葡萄球菌。

1.2.2 对苯唑西林耐药性检测的方法

在药敏报告为敏感前，用苯唑西林孵育整24h用以检测MRS，用头孢西丁时，金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌孵育16-20h，凝固酶阴性葡萄球菌需孵育24h。

1.2.2.1苯唑西林为基础的方法

以苯唑西林为基础的方法有琼脂稀释法，接种物为直接菌落悬液获得0.5麦氏浊度，使用1ul接种环蘸取菌液，在含4% NaCl MHA平板上涂成直径10-15mm斑点。

替代方法，用棉拭子蘸取菌液涂成类似大小的斑点或划清四分之一区。孵育条件为33-35℃；空气环境（试验温度高于35℃不能检出MRSA），孵育时间24小时，结果如用透射光仔细检查＞1个菌落或存在淡的膜状生长＞1个菌落则为苯唑西林耐药，结果判读见表1。

1.2.2.2 头孢西丁为基础的方法

头孢西丁纸片扩散法适用于金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，肉汤微量稀释法适用于金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌。纸片扩散法遵照标准纸片扩散法进行，肉汤微量稀释法遵照标准的肉汤稀释法进行，结果判读见表1。

1.2.2.3 分子检测法检测

检测mecA-基因、mecA-基因编码的蛋白或青霉素结合蛋白2a（PBP2a），是预测苯唑西林耐药的最准确的方法。 1.3 诱导性克林霉素耐药

检测主要针对对克林霉素结构性或诱导性耐药或只对大环内酯类耐药的金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和β-溶血性链球菌，检测方法见表2。

1.4 万古霉素的耐药性检测

使用MIC方法和万古霉素琼脂筛选法，不可使用纸片扩散法。

其中琼脂筛选法采取直接接种0.5麦氏浊度菌悬液，使用微量移液器吸取10ul菌液点种于琼脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸取菌液，挤去多余菌液，在平板上涂成直径10-15mm斑点或在部分区域划线接种，孵育条件为33-37℃，空气环境；用透射光仔细检查＞1个菌落或存在淡的膜状生长推测万古霉素敏感性降低。

2. 肠球菌属

分为青霉素/氨苄西林耐药、万古霉素抗药、高水平氨基糖苷耐药。

2.1 青霉素/氨苄西林耐药

产β-内酰胺酶肠球菌株较为少见，采用头孢硝噻吩为基础的β-内酰胺酶检测。β-内酰胺酶阳性的检测结果预示对青霉素及氨基、羧基、脲基青霉素耐药。检测方法参照葡萄球菌β-内酰胺酶检测方法。

2.2 万古霉素耐药

万古霉素抗药检测采用琼脂稀释法，接种方法为1-10ul 0.5麦氏浊度菌悬液点种于6ug/ml万古霉素的BHI琼脂平板上；或者用棉拭子蘸取菌液，挤去多余菌液，在平板上点种直径10-15mm斑点或划线接种，在33-37℃，空气环境孵育24小时，透射光下检查＞1个菌落包括小菌落或者模糊生长，则可以推测是万古霉素耐药。

2.3 高水平氨基糖苷耐药

高水平氨基糖苷耐药检测可使用纸片扩散法、肉汤微量稀释法、琼脂稀释法，见表3。

3. 肺炎链球菌

3.1 青霉素和第三代头孢菌素耐药

脑膜炎分离株用MIC法测试，并常规报告青霉素和头孢噻肟或头孢曲松或美罗培南的敏感性测试性结果；非脑膜炎分离株使用纸片扩散法苯唑西林≤19mm，要检测青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、或美罗培南的MIC；检测脑膜炎则需要检测青霉素注射剂等药物的MIC值。

革兰阴性菌耐药表型

革兰阴性杆菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药性的主要制药机制是产生了β-内酰胺酶，包括超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC酶、碳青霉烯酶（碳青霉烯类耐药肠杆菌科）。下面阐述这几种耐药性的检测方法。

1. ESBLs

ESBLs是A和D类中对抑制剂敏感的酶，可以由常见的质粒编码的β-内酰胺酶的基因突变引起，如TEM-1，SHV-1，OXA-10，CTX-M等。ESBLs可以使临床分离的肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌，大肠杆菌，变形杆菌和其它肠杆菌科细菌对青霉素，头孢菌素，氨曲南耐药。

肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌及奇异变形杆菌ESBLs筛选和确证实验采用纸片扩散法或肉汤微量稀释法。其中纸片扩散法培养基采用MHA，肉汤微量稀释法培养基采用CAMHB；接种物皆采用标准的方法；两种方法都有初筛试验和表征确证试验两部分。

确证试验中纸片扩散法的结果2个药物中有任何一个，在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比，增大值≥5mm，判定为产ESBLs；肉汤微量稀释法的结果与克拉维酸联合的药物MIC相对单独药物MIC减低≥3个倍比稀释度则判定为ESBLs。

2. AmpC酶

AmpCβ-内酰胺酶是C类不被抑制剂抑制的，由染色体或质粒编码的酶。产生AmpC酶的菌株和产生ESBLs的菌株有相似特征，降低对青霉素，头孢菌素，氨曲南的敏感性。

但是与ESBLs不同，AmpCβ-内酰胺酶还灭活头霉菌素，细菌表达AmpC酶后头孢西丁和头孢替坦敏感性下降。而且，产生AmpC酶的菌株不被β-内酰胺酶 抑制剂抑制。如果同时拌有孔蛋白基因突变或特定的外排泵的过表达，产AmpC酶菌株还可以耐碳青霉烯类药物。

染色体介导的AmpCβ-内酰胺酶主要存在肠杆菌，枸橼酸杆菌，沙雷和其他一些革兰阴性细菌中，通常表达水平低，但可被青霉素类，碳青霉烯类，和一些头孢类如头孢西丁诱导高水平表达。

III和IV代头孢菌素不诱导AmpC酶，但他们可以被水解；质粒介导的AmpC酶可以在细菌之间传播，主要存在于临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中。目前CLSI还没有确认的AmpC酶表型确证试验。

3. 碳青霉烯酶

在临床分离的肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶主要是A、B和D类β-内酰胺酶。KPC酶属于A类，NDM酶属于B类，OXD酶属于D类，是临床上的主要类型。产KPC酶可以使用改良Hodge试验确定，NDM酶和其它金属β-内酰胺酶需要乙二胺四乙酸（EDTA）结合抑制。

嗜麦芽窄食单胞菌，炭疽芽孢杆菌，脆弱类杆菌的某些菌株产生染色体金属β-内酰胺酶，另外一些金属酶可以通过质粒介导，如存在于不动杆菌，绿脓杆菌，粘质沙雷氏菌，肺炎克雷伯菌以及越来越多地在其它肠杆菌出现。

目前没有CLSI确定的表型试验以确认临床分离的菌株中存在金属β-内酰胺酶。

基因型药敏试验方法的应用

基因型药敏试验方法已广泛应用于商业自动化设备中。以VITEK 2COMPACT为例，AST-GP67卡包括21个药，可检测葡萄球菌、肠球菌、无乳链球菌的敏感性，同时可推测β-内酰胺酶产生、甲氧西林耐药、诱导克林霉素耐药、高水平氨基糖苷耐药，

例如头孢西丁筛选试验阳性或苯唑西林耐药，对所有β-内酰胺酶稳定和不稳定的青霉素类耐药；AST-GN14卡包括21个药，可检测肠杆菌科细菌的敏感性，同时可预测ESBLs的产生。

异常或罕见细菌耐药表型有金葡球菌对万古霉素、替考拉丁、利萘唑酮和奎奴普丁任意一种耐药；脑膜炎奈瑟菌对青霉素高度耐药和环丙沙星耐药；不动杆菌属、铜绿假单胞菌对多黏菌素E耐药，出现以上耐药表型时，需要用另一种药敏试验方法进行复核和确证。

文章摘自《临床实验室》杂志2014年第10期