Cre-loxP 基因重组技术

　re-loxP 是一种位点特异的基因重组技术，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，在真核生物和原核生物中均有广泛应用。

　　Cre-loxP 的基本原理

　　Cre 蛋白是一种重组酶，是causes recombination的缩写，于1981 年从 P1 噬菌体中被发现，属于 λInt 酶超基因家族。Cre 重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL 数据库登录号为 X03453），编码 38kDa 蛋白质，Cre 重组酶是由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。LoxP 位点，是 locus of X-over P1的缩写，是位于 P1 噬菌体中的 34bp 序列，由两个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定 loxP 的方向，loxP 位点的序列如下所示：

　　13bp 8bp 13bp

　　ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT

　　Cre 重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使两个 loxP 位点间发生基因重组。Cre 重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。

　　Cre-loxP 诱导基因重组的几种方式

　　当细胞基因组内存在两个 loxP 位点时，一旦有 Cre 重组酶出现，就会诱导两个 loxP 位点间的序列发生重组。首先，Cre 重组酶结合到两个 13bp 的回文序列形成二聚体，然后这个二聚体和另外一个 loxP 位点上的二聚体结合，形成四聚体。LoxP 位点是有方向的，形成四聚体的两个 loxP 位点是平行的，随后这两个 loxP 位点间的双链 DNA 被 Cre 重组酶切掉，然后切口在 DNA 连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于两个 loxP 位点的方向，主要有以下几种可能：

　　1.如果两个 loxP 位点位于一条 DNA 链上，且方向相同，Cre 重组酶能有效敲除两个 loxP 位点间的序列（图1A）；

　　2.如果两个 loxP 位点位于一条 DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能导致两个 loxP 位点间的序列翻转（图1B）；

　　3.如果两个 loxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上，Cre 酶能介导两条 DNA 链的交换或染色体易位（图1C）。

　　Cre-loxP 系统的优点

　　在当今世界上，Cre-loxP 系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，主要是因为该系统有如下优点：

　　图1. Cre-loxP诱导基因重组的方式，敲除（A）、翻转（B）、易位（C）

　　1. 高效性：Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效；

　　2. 特异性强：loxP位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的34bp元件，这种结构保证了loxP序列的唯一性，从而保证基因重组的特异性很强；

　　3. 可应用范围广：Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用，所以说Cre-loxP系统的可应用范围非常广；

　　4. 可由二型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的胜利条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。

　　Cre-loxP系统的操作方式

　　1. 转基因动物依赖的基因重组

　　一般情况下，科学家们利用Cre-loxP系统进行基因操作时，会采用两种转基因动物进行杂交，即一种带Cre的转基因动物和一种带loxP序列的转基因动物进行交配，使得后代既带Cre又带loxP基因，然后Cre重组酶会识别loxP位点，导致基因重组（图2）。由于Cre基因的表达受上游启动子的调控，这样启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。虽然该方法可以实现高效、特异的基因重组，但是以下不足限制了用转基因动物进行基因操作的发展：

　　1) 转基因动物的难以获得：目前虽然已经有一些Cre和loxP转基因动物，但是要获得这些转基因小鼠比较困难，特别是对于国内的科研工作者来说。而且还有很多Cre和loxP转基因动物没有被制作出来，或者没有公开发布或者在公共平台上保存，如果要自己制作转基因动物的话，非常耗时间而且成本也很高，因此说要获得需要的转基因动物比较困难；

　　图2. 用Cre和loxP转基因老鼠进行基因敲除操作

　　1) 动物交配很耗时间：转基因动物达到实验室后，首先需要将转基因动物的数量扩大，然后经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2个月时间，所以至少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠，因此说转基因动物的交配很耗时间；

　　2) 区域或者组织特异性不高：因为转基因小鼠依赖的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的调控，而有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求，这样就会使实验结果不精确。

　　1.病毒依赖的基因重组

　　由于转基因动物依赖的基因重组存在以上不足，现在越来越多的科研工作者开始采用比较灵活的方式使用Cre-loxP系统。通过病毒引入Cre或loxP元件，结合一种转基因小鼠是比较常用的方式（图3）。相比于转基因动物依赖的基因重组，病毒依赖的基因重组有以下优点：

　　1) 更强的区域特异性：由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染，再加上驱动Cre基因的特异性启动子，能够实现更强的区域和细胞特异性的基因重组；

　　2) 更少的花费：购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的，而且转基因动物的饲养、基因型鉴定都需要不少的人力、物力，而病毒的制备、保存和注射所花的费用相对来说是比较少的；

　　3) 更短的实验周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而转基因小鼠的交配过程特别耗时间，因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式，可以大量缩短实验周期。

　　图3. 病毒依赖的基因敲除操作示意图，注射Cre病毒进loxP转基因小鼠体内（A），或者注射loxP病毒到Cre转基因小鼠体内（B）

　　改造的Cre-loxP系统经过现代基因工程方法对Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。

　　1.对Cre元件的改造：对Cre元件的改造提高了Cre重组酶的活性，并且实现了药物可诱导性。例如，通过在Cre元件上引入真核细胞核定位序列NLS，Cre重组酶能在低表达丰度下实现重组，这对于一些低丰度的启动子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造过的配体结合结构域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD将定位在胞浆内，当人工合成的激素分子结合到Cre-LBD受体后，蛋白构象改变并进入核内，介导基因重组，目前使用最多的是tamoxifen诱导的CreERT2突变体，它的LBD来自于雌激素受体ER分子，当有tamoxifen的时候，Cre才能介导基因重组，这样通过控制tamoxifen的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控；

　　2.对loxP元件的改造：loxP元件也有一些突变体，间隔区和回文序列都可以进行突变，突变后的序列依然能被Cre重组酶识别和重组，但是突变的loxP序列必须和同样突变的loxP序列匹配介导基因重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样将不同的loxP序列组合用于控制多个基因，在同一Cre重组酶的作用下，可以实现多序列的基因重组，产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑（Brainbow）技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对loxP序列的改造实现。