骨髓基质干细胞修复颅骨缺损

骨髓基质干细胞修复颅骨缺损

1.实验动物

毕格犬平均1岁龄，雌雄不限。氯胺酮10mg/kg肌内注射诱导后，肌内注射速眠新o.1m1/kg全麻，常规消毒、铺巾。16号骨髓穿刺针于髂前上棘或股骨近端穿刺，抽取骨髓3-5ml，置于50m1离心管中(所用器械均事先肝素化)。2.BMSC培养及成骨诱导

3.细胞-生物材料复合物制备

pDBM(脱钙骨基质，上海市组织工程研究与开发中心研制)预先制备成2.5cm×2cm×0.3cm片状，细胞培养同前一部分。每块材料接种4×106经成骨诱导的BMSC，体外继续培养l～4天后，准备回植入动物体内。

4.动物实验试验分组

(1)实验组：颅骨缺损区植入pDBM/BMSC复合物。

(2)材料对照组：颅骨缺损区植入单纯pDBM。

(3)空白对照组：双侧颅骨区造成缺损后旷置。

5.手术回植

狗麻醉前禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮10 mg/kg肌内注射，进行诱导麻醉，速眠新0.1m1/kg肌内注射麻醉，整个过程中动物保持俯卧位。

动物麻醉平稳后，常规消毒铺巾，头部正中矢状切口，暴露双侧颅骨区，使用颅骨转，双侧各形成2.5cm×2cm全层颅骨缺损，同时去除缺损区骨膜，彻底止血。一侧缺损区为实验组，植入pDBM/BMSC另一侧为对照组植入无细胞单纯pDBM。

6.术后新生骨的评价

(1)三维CT检查：术后3、6个月颅骨三维CT检查。

(2)大体观察：术后3、6个月取材时，暴露双侧颅骨区观察愈合情况。

(3)组织学：术后3、6个月取材，实验侧和对照侧标本中部和边缘分别取材，石蜡包埋，组织学切片，进行HE和Azan三色染色。

(4)硬组织切片和四环素标记新生骨：术后3、6个月取材，实验侧和对照侧标本中部和边缘分别取材，取材前2周静脉滴注四环素(10mg/kg)。