载体多克隆位点（MCS）改造

　加、减、换一个载体 的MCS的位点 （给一个表达 载体加、减、换小表达标签，如His6， His10，strep II等，和MCS改造是一样的），其实技术 不是问题，问题在于位点的选择 ，因为载体设计 时应该设计者也考虑过mcs的问题，应该给使用者越多的选择越好，但为什么有的载体只给有限的几个位点呢，一可能是这个载体其他部位本身含有的限制性切点比较多，因而MCS位置的选择比较少，二就是设计者是自用的载体，没有考虑到我们的感受 。

　　因此如果你要加、减、换MCS，可以按一下几个步骤进行：

　　1、找到载体全序列 ，查找有没有你想要加的位点（Primer premier5……一堆软件 ，再不济了用word），如果没找到你想加、减、换的位点，恭喜了，革命要成功了；

　　2、方法上不太推荐点突变或其他以overlap PCR 为基础的技术，推荐小片段 克隆 ，也就是做shRNA 载体的那种方法，人工合成（按引物 合成）你想要的MCS序列的正反链，两端加上载体上两个切点的粘末端序列，人工退火（95度10min，然后每分钟降5度直至Tm值下5度，维持10min，即可），不用电泳检验，直接按克隆的连接体系将这个小片段与你的载体（相应酶双切）连接转化……

　　小片段连入的效率相当高，如果大家要检验：在菌长出来后，做PCR检验（人工合成的这个小片段的正链或反链与载体上的引物）。举个例子：

　　比如要在某载体的EcoR I和BamH I之间加一个新的MCS（EcoR V－Kpn I－Xho I－Hind III）（这几个位点必须在目的 载体上没有，如果有这个切点，你又实在想用的话，可以将目的载体用这个酶单切，绿豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化，再自连——位点封闭）：

　　1、合成 5‘－AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G -3'

　　3'－ G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'

　　EcoR I粘末端 EcoRV Kpn I Xho I Hind III BamH I粘末端 ； （这里面有几个要点，合成时直接合成粘末端，省得再切，这样既省合成的钱，效率又高，如果你需要在改造后的载体继续使用原载体的连入切点，比如上面例子的EcoR I和BamH I，你像例子中一样可以合成完整的酶切位点粘末端，如果你不想使用它们，那就只合成粘末端，比如上面那个例子，应合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……这样连接后，EcoR I切点就被封闭了；再有要注意考虑连入位点之间要留一定的间隔，因为靠着的两个酶是很难双切开的，有时候分步切都没用，因为留给酶结合的空间太小，没法结合l ，一般按照相邻两个酶的推荐保护碱基数中较大的数目留，万无一失啊）

　　2、退火，如上；

　　3、克隆，同上；

　　4、检验，同上。测序，收工。