重组克隆筛选（酶切鉴定）

【实验目的】

　　1.掌握质粒提取的基本方法的原理；

　　2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

　　【实验原理】

　　重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以β－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

　　1．β－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）

　　使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。lacZ编码β－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的β肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。重组子由于外源片断的插入使β肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为β－半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

　　2．快速裂解菌落鉴定质粒大小

　　从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

　　3．限制酶图谱鉴定

　　对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

　　4．Southern 印迹杂交

　　为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

　　5．PCR法

　　用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。

　　6．菌落（或噬菌斑）原位杂交

　　菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。

　　本实验采用限制酶图谱鉴定。

　　核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶，它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～8bp）, 以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5＇端为P，3＇端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA 特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μg DNA的酶量为一个单位。

　　【试剂与器材】

　　（一）试剂

　　1.质粒提取试剂

　　2.限制性内切酶Kpn I 及10×酶切缓冲液。

　　3.限制性内切酶Xbal I及10×酶切缓冲液。

　　4.TAE电泳缓冲液或TBE电泳缓冲液

　　5.琼脂糖（Agarose）

　　6.6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

　　（二）器材

　　水平电泳装置、电泳仪、水浴锅、恒温振荡器、台式高速离心机、微量移液器、凝胶成像系统等。

　　（三）菌株

　　大肠杆菌DH5α转化菌。

　　【操作方法】

　　1. 质粒提取步骤

　　2. 酶切反应

　　1)在灭菌的0.5mL EP管中加入重组质粒DNA 1μg和相应的10×M buffer 2μL（见附录1），再加入灭菌重蒸水至酶切总体积为20μL，将管内溶液混匀后各加入1μLKpn I和Xbal I酶液双酶切，用手指轻弹管壁使溶液混匀或用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好相同的组分后混匀分装，最后加入DNA样品。

　　酶切反应加样表：

　　2)混匀反应体系后，将EP管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2h-3h，使酶切反应完全。

　　3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0)，混匀，以停止反应，或置65℃水浴中10min，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，可参照说明书进行。灭活后的酶切溶液置于冰箱中保存备用。

　　4)琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果。

　　【注意事项与提示】

　　1.影响限制性内切酶活性的因素包括：

　　a)酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；

　　b)识别序列在DNA中的分布频率；

　　c)与DNA的构象有关（SC,L,OC）；

　　d)DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）

　　因此，酶切时应尽量注意将影响酶切的因素降低到最小。

　　2.市售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释；可采取适当延长酶切时间或增加酶量的方式提高酶切效率，但内切酶用量不能超过总反应体积的10%，否则，酶活性将因为甘油过量受到影响。

　　3.由于EDTA的存在会抑制连接酶的活性，通常采用加热方法终止酶切反应。

　　4.酶切反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。