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DNA实验

电子显微镜免疫细胞化学技术-- 电子显微镜免疫细胞化学技术概述

2024-09-27 DNA实验 加入收藏
第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献,但由于光学分辨率的限制,不可能从细

第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术

第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述

免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献,但由于光学分辨率的限制,不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。因此,Singer于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白(ferritin)标记抗体的方法,为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上,相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫细胞化学技术(以下简称免疫电镜技术技术)区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面:

一、组织固定与取材

在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构,又要注意保持组织的抗原性。因此,选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛―戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸―多聚甲醛液(Periodate―Lysine �Paraformaldehyde简称PLP液)。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液(其配制法见附录)。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术,认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳,因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成,抗原决定簇位于蛋白部分,有选择性地使糖类固定,就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类,使其产生醛基,再经赖氨酸作用,使新形成的醛基分子间和分子内相互连接,稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵,不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面,免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

二、免疫染色

分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

1.包埋前染色  即先行免疫染色,在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出,修整成小块,按常规电镜方法处理,经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小,为了准确定位,可作第二次包埋,即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间,中夹环氧树脂如夹心面包式,进行高温聚合,然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织,以中层较为理想。表层因受机械修整,结构往往保存不好,深层因抗体不能透入,免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片,寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验,半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察(指PAP染色法),免疫反应部位呈黑点状。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上,免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片,可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆,可取相连续的起薄切片,分别以两个铜网捞取,其中之一进行染色观察,另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

包埋前染色法的优点是:①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程,抗原未被破坏,易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片,提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织,但由于经过一系列的免疫染色步骤,常出现一定的超微结构损伤。

2.包埋后染色  组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后,再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色,故又名之载网染色(on grid staining)。必须指出的是:①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见,作者经验一般以不用四氧化锇为佳,或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为,从理论上讲,四氧化锇具有保存抗原的作用,但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中,铜网易与化学物质产生反应,故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中,应注意保持网面的湿润,网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好,方法简便,阳性结构有高度的可重复性,还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失;环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此,免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液,无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂,取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前,以H2O2液蚀刻数分钟,以去锇和增强树脂的穿透性。

3.超薄冰冻切片  按照Tokuyasu建立的方法,将组织置于2.3mol/L蔗糖液中,以液氮速冻,在冰冻超薄切片机上切片,切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤,直接进行免疫染色,所以抗原性保存较好,兼有包埋前和包埋后染色的优点。

三、包埋

(一)树脂包埋

国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法,可直接脱水后包埋,也可将小片组织或半薄切片贴在载片上,将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化,进行原位包埋。

(二)低温包埋

常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序,组织抗原性可能全部或部分丢失。因此,在免疫电镜技术方面,国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等,后者需配备冰冻超薄切片机,且技术难度较大,不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代,80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用,为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道,国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等,目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert―Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下:

1.Lowicryls 是丙烯酸盐(acrylate) 和甲基丙烯酸盐(methacrylate)化学物质,包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品(Polysciences INC),其特点是能在低温下保持低粘度(K4M:--35℃;HM20:-70℃;K11M、HM23:-60℃~-80℃)和具有在光照射(紫外光,波长360nm)下聚合的能力,它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性,特别适合于免疫细胞化学的应用,因它能较好地保持组织结构和抗原性,减少背景染色。HM20和HM23具疏水性,能产生高反差图像,适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多,现侧重介绍如下:

(1)包埋剂的配制:商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成:单体(Monomer),交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例,增加交联剂的量,组织块的硬度增加。中等硬度的组织块,其配制比例如下:

K4M:单体   17.30g

交联剂  2.70g

引发剂  0.10g

K11M:单体  19.00g

交联剂  1.00g

引发剂  0.10g

作者的经验,可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色的玻璃容器避光,用玻棒轻搅3~5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌,以防氧的气泡进入包埋剂中。

(2)生物样品处理程序(Lemanski 等1985)

①动物麻醉取材,以多聚甲醛―赖氨酸―过碘酸钠在9℃固定2h。

②磷酸缓冲液含7%蔗糖,pH7.2,冲洗过夜,0℃

③0.1mol/L 磷酸缓冲液,pH7.2,冲洗,0℃

④脱水:65%乙醇,1h ,0℃

80%乙醇,2h,-35℃

Lowicryl K4M:80%乙醇=1:11h -35℃

Lowicryl K4M:80%乙醇=2:11h -35℃

100% Lowicryl K4M 1h -35℃

100% Lowicryl K4M 过夜-35℃

⑤包埋:新鲜K4M置于胶囊内,将组织移入,在-30℃~-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W(Ladd Research Industries Burlington VT)相距30~40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡,照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2~3天,可增加其硬度,便于切片。

(3)免疫染色

①切片(厚50~70nm)贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸(0.25~0.45μm)滤过。

②正常羊血清30min。

③第一抗血清(PBS稀释),37℃2h。

④可用烧杯法(或塑料壶喷洗法),以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min,然后在第二烧杯中洗荡1h 。

⑤正常羊血清30min。

⑥第二抗血清(胶金标记抗体)以正常羊血清稀释为1:1,以镍网置于血清滴上孵育1h。

⑦冲洗如④。

⑧覆于2%OSO4水溶液上,30min。

⑨冲洗如④。


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