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DNA实验

纯合克隆筛选

2024-09-26 DNA实验 加入收藏
1.融化杂合突变ES细胞 ,ES/LIF培养液培养,每2~3天传代,实验开始把细胞 接种到三个100mm铺有凝胶碟皿中,每皿接种1~2106 细胞 。为筛选需用

1.融化杂合突变ES细胞 ,ES/LIF培养液培养,每2~3天传代,实验开始把细胞 接种到三个100mm铺有凝胶碟皿中,每皿接种1~2×106 细胞 。为筛选需用一个以上的ES杂合突变细胞系,因不同细胞系的转化效率不全相同,另外对检测细胞表型也需如此。

2.每皿细胞分别加入1.0~2.0mg/ml的G418(终浓度,pH7.4);应用neo和hyg基因作为筛选标记效果都很好,用hyg时浓度为1.0~2.0mg/ml的hygromycin-β的ES/LIF培养液。

3.培养细胞7~10天,每天换液,仍用含有适当浓度G418的ES/LIF培养液,培养至出现很多单个克隆为止;如细胞已长满而未出现单个克隆 时,应重复2,并加大G418浓度。

4.按前述杂合突变所述15~21步筛选法进行克隆筛选;在出现有杂交片段表示在纯合突变细胞中不存在无改变的靶基因。典型情况下,应有50%为纯合的,这是因为此过程是随机的,个别杂合克隆也可能产生纯合克隆 。

5.进行Northern分析mRNA,或用免疫吸印分析蛋白质,以确定靶基因是否表达。应是抑活的,即不表达,也不应有正常mRNA或蛋白质。      


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