VHCDR3基因文库和VL基因的扩增

[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  Geneclean试剂盒（Qbiogene）

●  VHFOR随机引物（见下文），10pmol/ul

●  LMB3引物

●  VHBACK引物；  5,-TTT GAC TAC TGG GGCCAG GG-3',  10pmol/u1

●  FdSEQ  引物：  5'-GAA  TTT  TCT  GTATGAGG-3',10pmol/ul

●  含起始scFv基因的质粒DNA

[方法]

1.设计并合成含有CDR3随机化序列的VHFOR引物。当然必须以拟进行亲和力成熟的抗体VH基因作为设计的基础。本例中，VHCDR3的7个氨基酸被随机化。在每个随机化位点中，保留了大约50%野生型氨基酸。引物设计结果如下：

VHFOR随机引物：  5'-CC CTG GCC CCA GTAGTC AAA 532 511 532 544 524 534     514 TTT CGC ACA GTA ATA AAC GGC-3,

随机化了7个连续的CDR残基。根据试验结果，我们可以得出以下结论：只有当溶剂可接近残基突变时，序列空间才能被更有效地利用。采用分子建模可以识别出这些残基。本例中随机化残基的选择就是根据分子建模的方法预测哪些残基具有溶剂可接近侧链的。

2. 配制2个50ul PCR反应混合液，1个用于VH基因的扩增。另1个用于VL基因的扩增，包含：

●  水，35.5ul

●  20XdNTP,  2.5ul

●  10XVent聚合酶缓冲液，5.0ul

●  反向引物（10pmol/ul），2.5ul

●  正向引物（10pmol/ul），2.5ul

●  scFv基因模板DNA（100ng），1.0ul

●  Vent DNA聚合酶（2单位），1.0ul

3. 在有加热盖的热循环仪内加热试管到94℃5分针。以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃ 2分钟的条件共循环30次，扩增V“基因和Vl基因。

4. 用1.5%琼脂糖胶纯化Vu基因丈库[350个碱基对（bp）]和VL基因  （320bp）；用 Geneclean试剂盒提取0NA.将每种产物重悬于30ul水中。在1.5%琼脂糖凝胶上与已知大小和农度的标准对照品比较，测定DNA浓度。