用噬菌粒载体制备单链DNA
原理噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 50
原理
噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 508 bp)不表达蛋白，但含有全部的顺式作用序列，该作用是病毒 DNA 合成起始和结束及噬菌体颗粒的形态发生必不可少的。
材料与仪器
大肠杆菌 F' 菌株 大肠杆菌 DH11S
卡那霉素 SDS 溶液 蔗糖凝胶加样缓冲液
琼脂糖凝胶 M9 基本培养基平板 YT 琼脂平板 水浴
卡那霉素 SDS 溶液 蔗糖凝胶加样缓冲液
琼脂糖凝胶 M9 基本培养基平板 YT 琼脂平板 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
卡那霉素（10 mg/ml)
SDS 溶液（2%，m/V）
蔗糖凝胶加样缓冲液
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%) 悬于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 培养基
加富的 M9 基本培养基平板
含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板
2 X YT 培养基
含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 2 X YT 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基
4. 专用设备
水浴，调至 65℃
5. 载体和菌株
噬菌体 M13K07 ( 辅助）
大肠杆菌 F' 菌株
大肠杆菌 DH11S
大肠杆菌 DH11S，用 M13 噬菌体的噬菌粒载体转化
大肠杆菌 DH11S，用带有外源 DNA 的 M13 噬菌体的重组噬菌粒载体转化
二、方法
高滴度辅助噬菌体原种的制备
成功使用噬菌粒的关键是制备已知精确滴度的辅助噬菌体原种。
1. 从加富的基本琼脂平板上挑取一个大肠杆菌 DH11S 的新鲜单菌落，接种 20 ml 2 X YT 培养基，温和揺动，37℃ 培养至 OD600 达 0.8。
2. 用 2 X YT 培养基制备一系列 10 倍稀释的 M13K07 噬菌体，将稀释的噬菌体铺板，以获得在 DH11S 细胞层中良好分离的噬菌斑。
3. 挑取分离良好的单个噬菌斑接种于装有 2~3 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。温和摇动（250 r/min), 37℃ 培养 12~16 h。
重要：以下步骤使用从单个新鲜挑取的噬菌斑获得的 M13K07 原种。
4. 将感染上清转移至 1.5 ml 无菌微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，4℃ 离心 2 min。上清转移至新管中 4℃ 保存。
5. 采用在一株支持 M13 噬菌体生长的大肠杆菌 F' 菌株（TGI、DH11S、NM522 或 XLl-Bkie) 中形成噬菌斑的方法，测定每个噬菌体原种的滴度。
原种的感染噬菌体颗粒滴度应为 1010 pfu/ml。弃去所有低滴度的原种。
用辅助噬菌体增殖重组噬菌粒
6. 在两块含有 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板上，取重组噬菌粒转化的和空噬菌粒转化的 DH11S 菌划线，37℃ 培养 16 h。
7. 挑取数个重组噬菌粒转化克隆和 1~2 个其亲本载体转化的克隆，接种至装有 2~3 ml 含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。
由于影响单链 DNA 得率的因素难以确定，应从每个噬菌粒重组体中挑取多个克隆，难以提高成功率。
8. 在每个培养管中加入 M13K07 辅助噬菌体至浓度为 2 X 107 pfu/ml。剧烈振荡 ( 300 r/min) 37℃ 培养 1.0~1.5 h。
在这种短时间培养后，细菌培养液应只是略浑，如果生长过旺，用预热的 2 X YT 培养基稀释培养物，直至浑浊恰能看见。
9. 在培养物中加入卡那霉素至终浓度为 25 μg/ml，37℃ 14~18 h。
由于噬菌体 M13K07 含有一个卡那霉素抗性基因，因而在这一步加入抗生素后，只有那些被感染了的细菌才能存活。
其他辅助噬菌体（如 R408 ) 不带抗生素抗性标记。在加入抗生素前应检査辅助噬菌体的基因型。
10. 将菌悬液转移至微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，室温离心 5 min, 分离菌体和培养基，将上清转移至新管中 4℃ 保存。
用凝胶电泳估计噬菌粒单链 DNA 的得率
11. 在 0.5 ml 微量离心管中分别加入 40 μl 上清与 2 μl 2% SDS, 轻拍管壁混合内容物，65℃ 温育 5 min。
估计含噬菌粒单链拷贝的病毒颗粒的得率。先将上清稀释后感染大肠杆菌 DH11S，然后铺于含氨芐青霉素（60 μg/ml）的 YT 琼脂平板。根据 37℃ 培养 24 h 后产生的氨芐青霉素抗性克隆数，计算上清中含噬菌粒单链 DNA 的病毒颗粒数，含 2 X 1011~ 5 X 1011 pfu/ml 的上清可以获得满意的纯化噬菌粒单链 DNA 得率。
12. 在每个噬菌粒 DNA 样品中加入 5 μl 加样缓冲液，混合后加至 0.7% 琼脂糖凝胶的加样孔。
13. 6 V/cm 电泳数小时，至溴酚蓝迁移至胶的大约一半。在紫外线下检査和照相。
得率随噬菌粒上外源 DNA 的大小和持性的不同而不同。但通常为约 1 μg/ml 培养物。
14. 从含大置单链 DNA 的上清中分离噬菌粒单链 DNA。按方案“M13 噬菌体单链 DNA 的制备”的步骤进行，将体积放大 2~3 倍。
噬菌粒和 M13 噬菌体载体一样，随外源 DNA 的大小和特性不同，其单链 DNA 的得率可以差五至十倍。 通常片段越大，得率越低。而且，即使外源 DNA 大小相同，其单链 DNA 的得率也可以有很大变化，如，大多数酵母 DNA 片段对噬菌粒的增殖，似乎没有问题，然而同样大小的人基因组 DNA 可能使单链 DNA 的得率令人失望。噬菌粒上外源 DNA 的插入方向和噬菌体 DNA 复制起点的方向也会对得率产生重要影响。因此，用相反方向重新克隆片段或换用噬菌体 DNA 复制起点方向相反的载体有时可以解决得率低的问题。
1. 缓冲液和溶液
卡那霉素（10 mg/ml)
SDS 溶液（2%，m/V）
蔗糖凝胶加样缓冲液
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%) 悬于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 培养基
加富的 M9 基本培养基平板
含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板
2 X YT 培养基
含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 2 X YT 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基
4. 专用设备
水浴，调至 65℃
5. 载体和菌株
噬菌体 M13K07 ( 辅助）
大肠杆菌 F' 菌株
大肠杆菌 DH11S
大肠杆菌 DH11S，用 M13 噬菌体的噬菌粒载体转化
大肠杆菌 DH11S，用带有外源 DNA 的 M13 噬菌体的重组噬菌粒载体转化
二、方法
高滴度辅助噬菌体原种的制备
成功使用噬菌粒的关键是制备已知精确滴度的辅助噬菌体原种。
1. 从加富的基本琼脂平板上挑取一个大肠杆菌 DH11S 的新鲜单菌落，接种 20 ml 2 X YT 培养基，温和揺动，37℃ 培养至 OD600 达 0.8。
2. 用 2 X YT 培养基制备一系列 10 倍稀释的 M13K07 噬菌体，将稀释的噬菌体铺板，以获得在 DH11S 细胞层中良好分离的噬菌斑。
3. 挑取分离良好的单个噬菌斑接种于装有 2~3 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。温和摇动（250 r/min), 37℃ 培养 12~16 h。
重要：以下步骤使用从单个新鲜挑取的噬菌斑获得的 M13K07 原种。
4. 将感染上清转移至 1.5 ml 无菌微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，4℃ 离心 2 min。上清转移至新管中 4℃ 保存。
5. 采用在一株支持 M13 噬菌体生长的大肠杆菌 F' 菌株（TGI、DH11S、NM522 或 XLl-Bkie) 中形成噬菌斑的方法，测定每个噬菌体原种的滴度。
原种的感染噬菌体颗粒滴度应为 1010 pfu/ml。弃去所有低滴度的原种。
用辅助噬菌体增殖重组噬菌粒
6. 在两块含有 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板上，取重组噬菌粒转化的和空噬菌粒转化的 DH11S 菌划线，37℃ 培养 16 h。
7. 挑取数个重组噬菌粒转化克隆和 1~2 个其亲本载体转化的克隆，接种至装有 2~3 ml 含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。
由于影响单链 DNA 得率的因素难以确定，应从每个噬菌粒重组体中挑取多个克隆，难以提高成功率。
8. 在每个培养管中加入 M13K07 辅助噬菌体至浓度为 2 X 107 pfu/ml。剧烈振荡 ( 300 r/min) 37℃ 培养 1.0~1.5 h。
在这种短时间培养后，细菌培养液应只是略浑，如果生长过旺，用预热的 2 X YT 培养基稀释培养物，直至浑浊恰能看见。
9. 在培养物中加入卡那霉素至终浓度为 25 μg/ml，37℃ 14~18 h。
由于噬菌体 M13K07 含有一个卡那霉素抗性基因，因而在这一步加入抗生素后，只有那些被感染了的细菌才能存活。
其他辅助噬菌体（如 R408 ) 不带抗生素抗性标记。在加入抗生素前应检査辅助噬菌体的基因型。
10. 将菌悬液转移至微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，室温离心 5 min, 分离菌体和培养基，将上清转移至新管中 4℃ 保存。
用凝胶电泳估计噬菌粒单链 DNA 的得率
11. 在 0.5 ml 微量离心管中分别加入 40 μl 上清与 2 μl 2% SDS, 轻拍管壁混合内容物，65℃ 温育 5 min。
估计含噬菌粒单链拷贝的病毒颗粒的得率。先将上清稀释后感染大肠杆菌 DH11S，然后铺于含氨芐青霉素（60 μg/ml）的 YT 琼脂平板。根据 37℃ 培养 24 h 后产生的氨芐青霉素抗性克隆数，计算上清中含噬菌粒单链 DNA 的病毒颗粒数，含 2 X 1011~ 5 X 1011 pfu/ml 的上清可以获得满意的纯化噬菌粒单链 DNA 得率。
12. 在每个噬菌粒 DNA 样品中加入 5 μl 加样缓冲液，混合后加至 0.7% 琼脂糖凝胶的加样孔。
13. 6 V/cm 电泳数小时，至溴酚蓝迁移至胶的大约一半。在紫外线下检査和照相。
得率随噬菌粒上外源 DNA 的大小和持性的不同而不同。但通常为约 1 μg/ml 培养物。
14. 从含大置单链 DNA 的上清中分离噬菌粒单链 DNA。按方案“M13 噬菌体单链 DNA 的制备”的步骤进行，将体积放大 2~3 倍。
噬菌粒和 M13 噬菌体载体一样，随外源 DNA 的大小和特性不同，其单链 DNA 的得率可以差五至十倍。 通常片段越大，得率越低。而且，即使外源 DNA 大小相同，其单链 DNA 的得率也可以有很大变化，如，大多数酵母 DNA 片段对噬菌粒的增殖，似乎没有问题，然而同样大小的人基因组 DNA 可能使单链 DNA 的得率令人失望。噬菌粒上外源 DNA 的插入方向和噬菌体 DNA 复制起点的方向也会对得率产生重要影响。因此，用相反方向重新克隆片段或换用噬菌体 DNA 复制起点方向相反的载体有时可以解决得率低的问题。
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