质粒DNA提取常见问题分析

1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？

细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用量增加。

2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？

（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用量减半。 （2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法：注意将细菌悬浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。 （4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。 （5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。

3.出现严重的RNA污染？

（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。 （2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。 （3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。

4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？

（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒DNA进行乙醇沉淀。 （3）质粒DNA在Solution II中暴露过久，易造成质粒DNA的切口断裂。裂解步骤控制在5分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。

5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？

（1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 （2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。 （3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。

6.加样时DNA飘出加样孔外？

忽略或省略了高速离心以甩干残留的Rinse B的操作步骤。解决方法：按说明书的操作步骤操作以确保残留的Rinse B被甩干。

7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？

是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。

8.质粒为何会丢失？

细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

9. 大肠杆菌老化：

请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 10. 质粒拷贝数低：

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 11. 菌体中无质粒：

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 12. 碱裂解不充分：

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加(以天根生化的质粒小提试剂盒中的溶剂配置为例)溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

13. 溶液使用不当：

溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 14. 吸附柱过载：

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 15. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 16. 乙醇残留：

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 17. 洗脱液加入位置不正确：

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 18. 洗脱液不合适：

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 19. 洗脱体积太小：

洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

20. 洗脱时间过短：

洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果