动植物样品的采集及DNA样品的提取（下）

3 植物总DNA 的提取     1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）分离（Murray，Thompson 1980）和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离（Sung，Slightom 1981）等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植物标本和化石中分离出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷冻保存。如果没有条件，最好在无水CaSO４ 瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取应尽快进行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。     提取DNA 的过程中有许多因素能导致DNA 降解。首先是物理因素。因为DNA 分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA 分子发生断裂。因此，在实际操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源DNA 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致DNA 降解。所以在提取DNA 的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液，以适应不同的植物材料。分离缓冲液的pH 值有时需要进行改进，pH 应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最适点在 5．0～6．0 之间，而DNA 酶pH 值最适点在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在过酸的条件下，DNA 脱嘌呤会导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多植物DNA 提取缓冲液的pH 值为8．0，有的甚至为9．0。缓冲液中包含了大量的复合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸钠）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸盐（DEPC）、溴化乙锭（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物质有些是抑制内切酶和非特异性核酸酶的，所以在其后的步骤中要将其除去。分离DNA 与蛋白质一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿对蛋白质均有极强的变性作用，而对DNA 无影响。下面的方法描述DNA 与污染物多糖的分离，也可用阴离子交换层析仪来进行。下面列出了3 种常见的分离植物总DNA 的方法。3 种方法溶解细胞膜和分离蛋白质的方法不同，各有其优、缺点。  3．1 CTAB 缓冲液方法     这是最广泛地用来分离植物DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂CTAB 溶解植物细胞膜，并与DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本（木乃伊、化石）到许多克的新鲜材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。  3．1．1 CTAB 的实验方法 1．材料 （1）2 倍CTAB 缓冲液： 100 mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值 8．0 1．4mol／dm３ NaCI 20 mmol／dm３ EDTA 2％ CTAB（W／V） 1％ PVP-360（W／V） 0．2％ß-巯基乙醇（体积比，用前在通风橱中加） （2）清洗缓冲液： 76％乙醇 10 mmol／dm３乙酸铵 （3）悬浮缓冲液： 10 mmol／dm３乙酸铵 0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8． 2．步骤 （1）加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。 （2）在热研钵中放人0．5～1．5g 新鲜或冰冻的叶子，用7．5ml 2 倍CTAB 分离缓冲液研磨（可加些石英砂帮助研磨）。对冻干的组织用1 倍CTAB 缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 缓冲液冲洗研钵，将冲洗液加到管中。 （3）将试管在60℃下放置30～60 分钟，然后轻轻振荡，使之充分混合后降至室温。 （4）在试管中加入10ml 氯仿－异戊醇（24:1）萃取液（如颜色深可再进行一次），轻轻摇晃使其混合，在室温下1500r／min 离心5 分钟，使其分相。 （5）将上层的水相倒入－15ml 管中，加2／3 体积的冷异丙醇，轻轻混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分钟或更长时间。 （6）室温下 800r／min 离心 3～5 分钟，如果看不到小团或沉淀，可在－20℃下放置 20分钟再离心。 （7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，这时的核酸一般松散地贴在管的底部，加 15ml清洗缓冲液，轻轻地旋转清洗沉淀物，15～20 分钟后核酸将变得更白。 （8）室温下800r／min 离心5 分钟（如不充分，则加大离心速度或延长离心时间），倒掉清洗缓冲液，将管倒扣在纸巾上，让沉淀物干燥，小心不要让DNA 滑掉。 （9）按沉淀物的大小用少量悬浮缓冲液（10～100 μl）悬浮DNA。 （l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下温育 30～60 分钟。 （11）如果组织包含单宁或其他次级产物，可以对 DNA 作进一步纯化（可用氯仿、苯酚纯化）。一些材料可能需要用氯铯（CsCl）梯度纯化。上述方法也可以进行改进，像巯基乙醇的浓度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗坏血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作悬浮缓冲液。 3．1．2 CTAB 沉淀法 1．材料 2 倍CTAB 分离缓冲液；沉淀缓冲液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。 2．步骤 （1）与7．3．1．1 中前4 个步骤同。 （2）吸取上层水相，将其例入一个15ml 管中。 （3）加 3 倍体积的沉淀缓冲液，使NaCI 的浓度减少到 0．35mol／dm３ ，室温下放置 30分钟。 （4）室温下 2 000r／min 离心 5 分钟，以沉淀 DNA。 （5）根据沉淀物的大小，用少量的悬浮缓冲液（10～100μl）悬浮DNA。 （6）虽然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是对那些包含单宁或其他次级产物的组织，可以在氯化铯梯度上进一步纯化。  3．2 蛋白质沉淀方法     这个方法可以产生高质量的DNA，但产量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸钾沉 淀蛋白质和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有机提取，而且快速，所以对大量样品比较合适。 1．材料     提取缓冲液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巯基乙醇（体积比），用之前在通风橱中加。 2．步骤 （1）用液氮在研钵中研磨1．0g 新鲜叶子，可以加一些石英砂帮助研磨。将研磨完毕的粉末贮存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要让植物材料融化。 （2）在冰冻的组织中加 6ml 提取缓冲液，转到一个15ml 的离心管中，充分振荡大约30 秒钟，使之混合均匀，然后在65℃下放置20 分钟。 （3）往管中加入2ml 5mol／dm３ 乙酸钾（pH 值6．5），充分摇匀，在冰水中放置5 分钟。随着不溶的十二烷基硫酸钾的沉淀，大部分蛋白质和多糖作为复合物被除去了。 （4）在 4℃下 2 000r／min 离心 20 分钟。 （5）吸出上清液，将其倒入一个干净的 15ml 的离心管中，不要带入颗粒物质，然后加 4ml 异丙醇轻轻混合，在－20℃下放置。 （6）在4℃下 2 000r／min 离心 15 秒钟，DNA 沉淀后，轻轻地倒掉上清液，在纸巾上倒扣10 分钟或更长时间，以干燥沉淀物。 （7）将沉淀物放在 100TE 中溶解，然后将溶液倒入一个1．sml 离心管中，离心 5分钟，移去不溶的沉淀。 （8）将管中上清液倒入另一个 1．5ml 离心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷异丙醇，充分混合，在—20℃下放置1～2 小时，拿出后再在室温下放10 秒钟，使管中DNA 沉淀。 （9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分钟，离心 1 分钟，干燥沉淀物 10 分钟。 （10）根据DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。  3．3 氯化铯方法     这个方法的原理是根据在氯化铯（CsCl）中的不同密度梯度来分离细胞成分。此方法可以产生大量高纯度的DNA，但费时，而且需昂贵的仪器设备，对需要复杂的有机提取或沉淀的材料比较适合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情况下，它可能是在含大量次级产物的植物中提取高质量DNA 的唯一方法。DNA 可以在一个平衡的CsCl 梯度中通过与以下几个染料中的一个结合而被纯化， 这几个染料为溴化乙锭（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙锭（propidium iodide）、Bisbenzimide，它们不同的 3．4 PCR 小量制备法     此方法的优点是一次可以提纯很多样品，比较快速，而且小于10mg（50mm）的新鲜叶子材料就可以产生足够的DNA，产生的DNA 对杂交实验是可用的（Millgan 1992）。这个方法存在的问题是DNA 沉淀物可能不够紧密，或不一定能形成一紧密的DNA 沉淀。 1. 材料     分离缓冲液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３ NaCI；25 mmol／dm３ EDTA； 0．5 ％ SDS。 2．步骤 （1）用1．5ml 离心管研磨小的组织样品。可取管口大小的新鲜叶子（＜10mg），冻在液氮中 的叶子也可用。 （2）在研碎的样品中加 400μl 的分离缓冲液，用适合的速度涡旋 10 秒钟，以分散开样品。 （3）在室温下将1．5ml 离心管中样品离心 12～15 分钟，沉淀细胞内物质。 （4）搜集300μl 的上清液，弃去沉淀。 （5）在上清液中加300μl 预冷异丙醇，倒转样品1～3 次，使之充分混合，在室温下至少放 置5 分钟。 （6）将微离心管中的样品在室温下离心20 分钟，以搜集沉淀的DNA。 （7）弃去上清液，用300μl 80％的乙醇室温下沉淀 10 分钟。 （8）室温下离心样品12 分钟，弃去上清液。 （9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室温下离心 5 分钟，弃去上清液。 （10）室温下干燥样品1 小时或将样品放过夜。 （11）用 100μl TE 悬浮样品。 相关链接：动植物样品的采集及DNA样品的提取（上）动植物样品的采集及DNA样品的提取（下）