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DNA实验

DNA抽提指南(TRIZOL)

2024-10-11 DNA实验 加入收藏
按照RNA 分离操作方案在完全移去水样层后,匀浆中的DNA 存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后,DNA 溶解在8 mM NaOH中。用

 按照RNA 分离操作方案在完全移去水样层后,匀浆中的DNA 存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后,DNA 溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA 可以用来做样品中DNA 含量的测定。同时抽提的基因组DNA 可以用于对Northern analysis的结果进行标准化,因为DNA 变异程度比总RNA 或组织重量要小。[由于来源的不同,所得到的DNA 沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤(例如苯酚抽提等等)。]

  实验所需但试剂未提供的物品:

  * 酒精

  * 0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)

  * 75%酒精

  8 mM NaOH

  如无例外,以下操作均应在15―30℃下完成。

  1.DNA 的沉淀

  移除中间层上残余的水样层,用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA 。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇,反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15―30℃下2―3分钟,再在2―8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA 。

  小心移除水样层对抽提的DNA 的质量至关重要。

  2.DNA 的洗脱

  移除离心后苯酚层中的上清液,如有必要,可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)洗涤DNA 沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA 沉淀在15―30℃下作用30分钟(期间周期性混匀)再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后,用75%的酒精重悬DNA 沉淀(每1 ml TRIZOL加1.5―2 ml75%酒精),在15―30℃下放置10―20分钟(期间周期性混匀)然后再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。

  对于较大的DNA 沉淀(> 200 μg)或样品中含有较多的非DNA 物质需要用0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)溶液再洗涤一次。

  3.DNA 的再溶解

  在开口的试管中空气干燥DNA 5―10分钟。(不要用离心干燥;它会使得DNA 极难溶解。)用8m M的NaOH溶解DNA ,大致的比例为0.2―0.3 μgDNA /μl。一般来说,每107个细胞或每50―70 mg组织要加300―600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA 是高度值得推荐的,因为抽提的DNA 在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9,一旦DNA 溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中,DNA 样品(尤其是来自组织的样品)可能含有一些不溶解的胶样物质(细胞膜碎片等)。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA 得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在4℃下放置过夜;如果是长期保存,样品中还应该用HEPES将pH值调到7―8并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后,dna可以保存于4℃或-20℃。

  DNA 的定量及预期的产量

  取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA 样品,以适当比例和水混合并测量混合液A260值,以双链DNA 的A260值计算DNA 含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA /ml。若以细胞数分析其相应的DNA 产量,大致遵循以下比例:每1×106个分别来源于人,大鼠,小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg,6.5μg,和5.8μgDNA 。

  应用:

  通过PCR扩增DNA :

  在DNA 再溶于8mM NaOH后,用0.1 M的HEPES将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA 样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。

  限制性核酸内切酶酶切反应:

  用HEPES将DNA 溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案,也可以用pH值为7―8的1 mM EDTA透析DNA 样品。每ug的DNA 加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行,反应时间为3―24小时。在标准的测定中,80―90%的DNA 是可被消化的。

  溶于8 mM NaOH中DNA 样品pH值的调整:

  (每1 ml 的8 mM NaOH使用以下数量的0.1 M 或1 M HEPES,游离酸。)

  DNA 抽提注意事项:

  1.苯酚层和中间层可以在2―8℃下放置过夜。

  2.溶于75%酒精中的DNA 可以在2―8℃下放置数月。

  3.溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在2―8℃下放置过夜,若要长期保存,将其pH值调整到7―8,并调整EDTA的浓度到1 mM。

  疑难解答:

  DNA 抽提

  •每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA 产量

  1.肝和肾,3―4μg

  2.骨骼肌,脑组织,和胎盘,2―3μg

  3.培养的人,大鼠,小鼠细胞(1×106),5―7μg

  4.纤维母细胞,5―7μg

  •产量低

  1.样品匀浆化或裂解不完全。

  2.终DNA 不完全再溶解。

  •A260/280比值<1.70

  1.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA 样品。

  2.DNA 样品中的苯酚没有完全去除。用0.1 M的柠檬酸钠(用10%酒精配制)再洗涤DNA 沉淀一次。

  •DNA 降解

  1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。

  2.用于抽提的样品,或已经抽提的RNA 样品存放于-5―-20℃,而没有存放于-60―-70℃。

  3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。

  •RNA 污染

  1.水样层没有完全去除。

  2.用0.1 M的柠檬酸钠(用10%酒精配制)洗涤DNA 沉淀不完全。

  •其他的应用方面

  在行PCR扩增前调整pH值到8.4。

  对用于限制性核酸内切酶消化的DNA ,调整其pH值到所需的范围,每μg的DNA 加3―5单位的酶,对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3―24小时内。一般而言,80―90% 的DNA 均可以被消化。


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