DNA抽提指南(TRIZOL)

　按照RNA 分离操作方案在完全移去水样层后，匀浆中的DNA 存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后，DNA 溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA 可以用来做样品中DNA 含量的测定。同时抽提的基因组DNA 可以用于对Northern analysis的结果进行标准化，因为DNA 变异程度比总RNA 或组织重量要小。[由于来源的不同，所得到的DNA 沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤（例如苯酚抽提等等）。]

　　实验所需但试剂未提供的物品：

　　* 酒精

　　* 0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）

　　* 75%酒精

　　8 mM NaOH

　　如无例外，以下操作均应在15―30℃下完成。

　　1.DNA 的沉淀

　　移除中间层上残余的水样层，用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA 。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇，反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15―30℃下2―3分钟，再在2―8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA 。

　　小心移除水样层对抽提的DNA 的质量至关重要。

　　2.DNA 的洗脱

　　移除离心后苯酚层中的上清液，如有必要，可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA 沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA 沉淀在15―30℃下作用30分钟（期间周期性混匀）再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后，用75%的酒精重悬DNA 沉淀（每1 ml TRIZOL加1.5―2 ml75%酒精），在15―30℃下放置10―20分钟（期间周期性混匀）然后再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。

　　对于较大的DNA 沉淀（> 200 μg）或样品中含有较多的非DNA 物质需要用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）溶液再洗涤一次。

　　3.DNA 的再溶解

　　在开口的试管中空气干燥DNA 5―10分钟。（不要用离心干燥；它会使得DNA 极难溶解。）用8m M的NaOH溶解DNA ，大致的比例为0.2―0.3 μgDNA /μl。一般来说，每107个细胞或每50―70 mg组织要加300―600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA 是高度值得推荐的，因为抽提的DNA 在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA 溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中，DNA 样品（尤其是来自组织的样品）可能含有一些不溶解的胶样物质（细胞膜碎片等）。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA 得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在4℃下放置过夜；如果是长期保存，样品中还应该用HEPES将pH值调到7―8并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后，dna可以保存于4℃或-20℃。

　　DNA 的定量及预期的产量

　　取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA 样品，以适当比例和水混合并测量混合液A260值，以双链DNA 的A260值计算DNA 含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA /ml。若以细胞数分析其相应的DNA 产量，大致遵循以下比例：每1×106个分别来源于人，大鼠，小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg，6.5μg，和5.8μgDNA 。

　　应用：

　　通过PCR扩增DNA ：

　　在DNA 再溶于8mM NaOH后，用0.1 M的HEPES将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA 样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。

　　限制性核酸内切酶酶切反应：

　　用HEPES将DNA 溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案，也可以用pH值为7―8的1 mM EDTA透析DNA 样品。每ug的DNA 加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行，反应时间为3―24小时。在标准的测定中，80―90%的DNA 是可被消化的。

　　溶于8 mM NaOH中DNA 样品pH值的调整：

　　（每1 ml 的8 mM NaOH使用以下数量的0.1 M 或1 M HEPES，游离酸。）

　　DNA 抽提注意事项：

　　1.苯酚层和中间层可以在2―8℃下放置过夜。

　　2.溶于75%酒精中的DNA 可以在2―8℃下放置数月。

　　3.溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在2―8℃下放置过夜，若要长期保存，将其pH值调整到7―8，并调整EDTA的浓度到1 mM。

　　疑难解答：

　　DNA 抽提

　　•每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA 产量

　　1.肝和肾，3―4μg

　　2.骨骼肌，脑组织，和胎盘，2―3μg

　　3.培养的人，大鼠，小鼠细胞(1×106)，5―7μg

　　4.纤维母细胞，5―7μg

　　•产量低

　　1.样品匀浆化或裂解不完全。

　　2.终DNA 不完全再溶解。

　　•A260/280比值<1.70

　　1.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA 样品。

　　2.DNA 样品中的苯酚没有完全去除。用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）再洗涤DNA 沉淀一次。

　　•DNA 降解

　　1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。

　　2.用于抽提的样品，或已经抽提的RNA 样品存放于-5―-20℃，而没有存放于-60―-70℃。

　　3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。

　　•RNA 污染

　　1.水样层没有完全去除。

　　2.用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA 沉淀不完全。

　　•其他的应用方面

　　在行PCR扩增前调整pH值到8.4。

　　对用于限制性核酸内切酶消化的DNA ,调整其pH值到所需的范围，每μg的DNA 加3―5单位的酶，对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3―24小时内。一般而言，80―90% 的DNA 均可以被消化。