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DNA实验

大片段DNA的琼脂糖凝胶回收

2024-10-12 DNA实验 加入收藏
大片段:指的是片段大小超过10kb的DNA 片断,由于越长的DNA 分子和纯化膜的结合力越强,洗脱力越差,在离心过柱时可能被“扯断”,因此常规的离心过柱的方法并

大片段:指的是片段大小超过10kb的DNA 片断,由于越长的DNA 分子和纯化膜的结合力越强,洗脱力越差,在离心过柱时可能被“扯断”,因此常规的离心过柱的方法并不适合大片段DNA 的回收。在凝胶电泳的大片断回收,特别是几十kb的大片断,经典方法是电洗脱。

此外,低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法,新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料。其实无论用什么方法,在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断,操作时一定要小心注意,粗暴的操作,最后结果也是自己来承受的。

这些方法中,速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟,谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢?有那功夫干点别的不好?我最早用的其实是当时的Pharmacia(后来改为Amersham,现在是GE Healthcare Life Sciences)的一个玻璃奶(Glassmilk)试剂盒。

现在记得Glassmilk的人应该不多了,在当时却是我们眼中的神奇宝贝――半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活:溶胶液溶胶后,加入10ul混匀的玻璃奶溶液,混匀静置吸附后,离心去上清,再清洗1―2次,干燥,最后用洗脱液洗脱,离心取上清即可。

1.QIAEX II

产地:Qiagen

回收范围:40bp-50kb

特点:

通用性高:一般或者低熔点琼脂糖凝胶,TAE或TBE,以及聚丙烯酰胺凝胶

无NaI干扰后续实验

大片段DNA 保存较好,不会被剪切

使用心得:

这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒,利用的是配合高离液盐(chaotropic salt)的silica-gel particles,因此QiaEX可以从盐,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,染料,蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA 片段。

这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样,区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃,因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况,在离心力下,大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同,当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上,离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠(Beads),能更好的吸附DNA ,也不易产生上述的剪切力问题,使得回收的大片断DNA 更为完整。

无论是玻璃奶还是纯化填料,比起过柱的方法,优点在于适用于较大范围的DNA 回收,从小片断到超级大片断都可以,适用范围广;而且每次反应可以根据估算的待回收DNA 的量来放大或者缩小纯化试剂的量,比较灵活。比如QIAEX说是150反应(每次5ug),实际上往往可以用200多次或者更多。

但是这个方法的问题有2个,一个是比较麻烦,需要一定操作经验――无论是清洗或者是最后的洗脱,离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀,多少有点点难度,特别是最后取洗脱的DNA ,要舍得放弃最后那点上清,免得回收产物中混入了纯化介质,在后面的实验中得不偿失。所以,你可以从此想象,由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的,去除始终不彻底,这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高,回收率也不如那么高。你看,QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR,但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。

另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验――干过头了洗脱困难,没干透就会将酒精带入后继实验――要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然,这个现象描述起来不着边际,做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题,就是离心充分,离心后取管子动作轻快,事前调好加样枪,取上清要轻,靠壁、放枪缓,动作利索,不要千万不要来回抽。舍得放弃。

QiaEX相关参数:

DNA sizeRecovery*


44 bp75%
75 bp75%
500 bp95%
7.5 kb85%
23.5 kb75%
48.5 kb60%
Binding capacity:5 µg DNA per 10 µl QIAEX II suspension
Recovery:60�95% of DNA fragments (40 bp � 50 kb)
Elution volume:Elution volume: 20 µl

类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit


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