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DNA实验

DNA 体外重组

2024-05-18 DNA实验 加入收藏
简介DNA 体外重组,又称基因克隆,是基因操作中最基本的技术,也是分子生物学的核心技术。DNA 体外重组包括:欲进行重组的 DNA 片段(常称为目的 DNA)


简介

DNA 体外重组,又称基因克隆,是基因操作中最基本的技术,也是分子生物学的核心技术。


DNA 体外重组包括:

  1. 欲进行重组的 DNA 片段(常称为目的 DNA) 的获取;

  2. 载体的选择及准备;

  3. 目的 DNA 片段与载体的连接;

  4. 重组 DNA 导入宿主细胞;

  5. 含重组 DNA 宿主细胞的克隆化及鉴定。



原理

DNA 体外重组 ( DNA recombination in vitro) 的基本原理是将 2 个或 2 个以上 DNA 分子通过体外连接、体内克隆扩增的方法组成一个新 DNA 分子的过程。

用途

DNA 体外重组可用于构建基因文库、外源表达基因、基因改造即基因定点诱变等。

材料与仪器

试剂:
限制性内切核酸酶、DNA 连接酶、载体、乙醇、氯仿/异戊醇、RNase、琼脂糖、溴化乙啶、大肠杆菌菌株,LB 培养基,100 mM CaCl,DMSO/ 2 -巯基乙醇
仪器:
水浴锅、PCR 仪、培养箱、离心机、振荡器

步骤

DNA 体外重组的基本操作步骤包括:

一、基因组 DNA 的制备

(一)从哺乳动物组织中提取基因组 DNA

  1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存;

  2. 将 200 mg~1 g 的组织用预冷的研钵研碎,或用锤子将其捣为细粉末,每 100 mg 组织用 1.2 ml 消化缓冲液悬浮,然后于 50℃ 摇荡温育 12~18 h;

  3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品,1700×g,离心 10 min。如果样品溶解得不好,再加 1 体积不含蛋白酶 K 的消化缓冲液,重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质,重复抽提一次,将上层 (水溶液) 转移至一个新离心管中;

  4. 加入 1 / 2 体积 7.5mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 100% 乙醇,12 000rpm 离心 2 min;

  5. 用 70% 乙醇洗涤,晾干,沉淀用 TE 缓冲液或无菌双蒸水重新溶解, 使终浓度在约 1 mg/ml。注: 加入 0.1% 的 SDS 和 1? 滋 g/ml 无 DNA 酶的 RNA 酶,37℃ 温育 1 h,以除去残留的 RNA。

  6. 重复步骤 4、5。1 g 细胞大约能提取到 2 mg DNA。

(二)从植物组织中提取基因组 DNA

  1. 在所需量的 CTAB 抽提液中加入 2 -巯基乙醇,使终浓度达 2% (v/v)。将此溶液及 CTAB/NaCl 溶液加热至 65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要 4 ml 的 2 -巯基乙醇/CTAB 抽提液和 0.4~0.5 ml 的 CTAB/NaCl 溶液;

  2. 用液氮 (- 196℃) 或干冰 (- 78℃) 冷冻匀浆器,将植物组织粉碎成为细粉,然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中;

  3. 往粉碎的组织中加入预热的 2 -ME/CTAB,混合使之充分湿润,于 65℃ 温育 10~60 min,期间不时混匀;

  4. 用等体积的 24:1 氯仿/异戊醇抽提匀浆液,上下颠倒充分混合,7500×g,4℃,离心 5 min,回收上层水相;

  5. 加入 1 / 10 倍体积的 65℃ 预热 CTAB/NaCl 溶液,上下颠倒混匀;

  6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提,混匀,离心,回收上层水相;

  7. 加入 1 倍体积的 CTAB 沉淀液,上下颠倒混匀,如果沉淀可见,继续做步骤 8,也可于 65℃ 温育 30 min;

  8. 500×g,4℃,(或约 2700rpm) 离心 5 min;

  9. 移出上清,用高盐 TE 缓冲液重悬沉淀 (按每克起始材料加 0.5~1 ml),如果沉淀很难溶解,于 65℃ 温育直至所有的或大部分沉淀溶解;

  10. 加入 0.6 倍体积异丙醇沉淀核酸,充分混匀,7500×g,4℃,离心 15 min;

  11. 用 75% 乙醇洗涤沉淀物,干燥,用尽可能少的 TE 或水重悬 (每克起始材料 0.1~0.5 ml)。

二、质粒 DNA 的制备

(一)质粒的小量制备:

  1. 将 5 ml LB 培养液 (含筛选抗生素) 加入到容量为 15 ml 并通气良好的试管中,然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中,37℃ 以 225rpm 速度振荡培养 14 - 16 h;

  2. 10,000rpm,4℃ 离心 5 min,弃培养液;

  3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来,室温放置 5 min;

  4. 加入细菌裂解液,上下颠倒微量离心管以裂解细菌,待溶液变黏稠为止;
  5. 加入中和液,上下颠倒混合后置冰上 5 min,12,000rpm,4℃ 离心 5 min;

  6. 将上清移至另一离心管中 (注意不要混入白色沉淀物),加入等体积的 TE 饱和酚/ 氯仿 (1:1) 混合液,振荡混匀 1 min,12,000rpm 离心 2 min;

  7. 将上层水相移至另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1) 溶液,振荡混匀 1 min,12,000rpm 离心 2 min;

  8. 将上层水相移至另一离心管中,加入 2.5 倍体积的无水乙醇,置- 20℃ 沉淀 15 - 30 min,然后 12,000 rpm 离心 15 min;

  9. 弃上清,于沉淀中加入 100? 滋 L 双蒸水或 TE(pH8.0) 溶解沉淀,加入 20? 滋 g/ml RNase,置室温 30 min,然后加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1),振荡混匀 1 min,12,000rpm 离心 2 min,将上层水相移至另一离心管中,加入 0.1 倍体积 3M NaAc(pH5.2) 和 2.5 倍体积无水乙醇,置- 20℃ 沉淀 15~30 min,然后离心 15 min;

  10. 弃上清,加入 70% 乙醇 ( 注意不要混合),12000rpm 离心 10 min;

  11. 弃上清,真空干燥或自然干燥质粒 DNA;

  12. 用去离子水溶解质粒 DNA,- 20℃ 保存备用。

(二)质粒的大量制备:

  1. 将 5 ml 转化菌种接种于 500 ml LB 培养液 (含用于筛选的抗生素) 中,37℃ 以 225rpm 速度振荡培养 12~16 小时;

  2. 10,000rpm,4℃ 离心 15 min 收集菌体;

  3. 将细菌悬浮于 100 ml 预冷的 STE(0.1M NaCl,10 mM Tris.Cl,pH8.0,1 mM EDTA,pH8.0)中,12,000rpm 离心收集菌体;

  4. 将菌体悬于 10 ml 细菌悬浮液中,再移至 50 ml 离心管中;

  5. 加入 1 ml 用 10 mM Tris.Cl (pH 8.0) 新鲜配制的溶菌酶溶液 (10 mg/ml),混合后室温孵育 30 min;

  6. 加入 15 ml 新鲜配制的细胞裂解液,上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止;

  7. 加入 10 ml 预冷的中和液,上下颠倒混匀,冰浴 10 min;

  8. 12,000rpm,4℃ 离心 20 min;

  9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一 50 ml 离心管中,加入 0.6 倍体积的异丙醇,室温放置 10 min,12,000rpm,室温离心 5 min;

  10. 弃上清,于沉淀中加入水和 RNase,置室温 30 min,然后用氯仿/异戊醇 (24:1) 抽提一次,于上层水相中加入 0.1 倍体积 3M NaAC(pH5.2)和 2.5 倍体积无水乙醇,- 20℃ 沉淀 15 min,12,000rpm 离心 15 min;

  11. 弃上清,用 75% 乙醇室温洗一次,12,000rpm,离心 10 min;

  12. 弃上清,真空干燥或自然干燥质粒 DNA;

  13. 加适量去离子水或 TE 缓冲液 (pH8.0) 溶解质粒 DNA,- 20℃ 保存备用。

三、 DNA 酶切后片段回收与载体连接

  1. 酶切 DNA 反应,在 75℃ 加热 15 min 灭活酶活性;

  2. 10×CIP 缓冲液和 1U CIP,混合后,37℃ 孵育 30~60 min,然后 75℃ 加热 15 min 灭活 CIP 活性;

  3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的 DNA 片段用于连接反应。

连接反应:连接体系混合后置 14~16℃ 水浴 6~12 h。

四、重组质粒的转化

(一)感受态细胞的制备

  1. 将大肠杆菌菌株在 LB 琼脂培养基上画线,37℃ 培养 12~16 h;

  2. 次日从琼脂平板上取一单菌落于 2 ml LB 培养基中,37℃ 以 200 rpm 速度振荡培养 12~16 h;

  3. 取 1 ml 上述培养物接种于 100 ml LB 培养基中,37℃ 以 200 rpm 的速度震荡培养直至 A600 值为 0.5~0.6 (大约 3 h);

  4. 将菌液置冰浴 10 min,然后 2,500×g,4℃ 离心 20 min 收集菌液;

  5. 弃上清,倒置离心管 1 min 除净剩余液体,然后加入 10 ml 冰冷的 100 mM CaCl液悬浮细胞,冰浴 10 min;

  6. 4000rpm,4℃ 离心 10 min 回收细胞,弃上清,每 50 ml 原培养物再加入 2 ml 冰冷 100 mM CaCl2 溶液悬浮细胞;

  7. 按每份 200? 滋 l 分装,4℃ 可保存 1~2 周。若需长期保存,可加甘油至终浓度为 15%,置- 70℃ 备用。


(二)重组质粒的转化

  1. 将感受态细胞置冰上融化,然后加入 DMSO 或 2 -巯基乙醇,混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒),温和混匀,置冰上 30 min;

  2. 42℃ 水浴 45 秒,然后迅速放回冰中 1~2 min;

  3. 加入 2 ml LB 培养液,37℃ 轻摇荡培养 1 h;

  4. 4,000×g 离心 10 秒钟,弃上清,用 LB 培养液重悬菌体;

  5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上,涂匀,室温放置 20~30 min,倒置于 37℃ 孵箱中培养 12~16 h。

(三)转化细胞的筛选


(四)质粒和菌株的保存

  1. 质粒可以在- 20℃ 冰冻保存。

  2. 菌株可在含 8~15% 甘油培养液中- 20℃ 或- 70℃ 保存。也可在半固体 LB 琼脂培养基中穿刺保存。

注意事项

DNA 体外重组的注意事项有:


(一)选择载体的基本原则:一是明确选用载体的基本目的,二是了解载体的基本结构和功能元件。载体选择一般应考虑以下几点:1 目的 DNA 片段的大小;2 明确重组的目的;3 合适的克隆位点;4 载体的稳定性。

(二)选择载体需要考虑的因素:选择载体时除了遵守上述基本原则外,还应考虑一些可能对操作 DNA 有影响的因素,包括载体提供的一些重要元件及其位置、可用于操作的位点以及载体在宿主细胞中的行为方式等。

(三)因为 RNA 易被 RNase 降解;整个操作不能有 RNase 的污染,同时要注意无菌操作。

(四)所有试剂的配制均用 DEPC 处理过的水。

(五)溴化乙啶是致癌剂,并有中度毒性,实验中要戴防水手套,不要污染环境。紫外灯下观察结果时,应戴防护眼镜。



常见问题

DNA 体外重组的常见问题:连接效率低下;
解决方案:通常 DNA 插入片段与载体 DNA 的摩尔比为 3:1 或 2:1,需根据 DNA 分子量计算,而不取决于浓度;平齐末端连接时,插入片段的量要远远大于载体 DNA 的量,可以为 5:1 或更多。有时 DNA 一端是粘端,另一端是平端,这种连接与双酶切粘端连接相似;不匹配末端需要连接时,首先要将末端处理成平端,然后再进行连接反应。



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