DNA抽提标准化操作规程

1 目的 ：DNA 抽提标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA 抽提操作。

2 适用范围 ：DNA 抽提实验室

3 依据 ： DNA 抽提标准化操作规范

4 引用文件 ：德国BAG公司（以下简称BAG）《Instructions for use EXTRA-GENE I》

5 程序

5.1试剂准备

5.1.1 BAG® EXTRA-GENE I

该试剂盒包括3部分：Solution 1 、Solution 2、Solution 3

使用前，若Solution 2有沉淀请将其在37℃孵育，直至沉淀完全溶解

5.1.2 乙醇溶液，浓度（V/V）为96%或100%

5.1.3 乙醇溶液，浓度（V/V）为70%

5.1.4 灭菌蒸馏水，按照灭菌蒸馏水配制标准操作规范

5.2仪器及用具准备

5.2.1 移液器，规格：20µl � 200µl、200µl � 1000µl

5.2.2 移液器配套吸头，规格：200µl和1000µl，灭菌、无DNA /RNA 残留

5.2.3 Eppendorf离心管，规格：1.5ml 或2.0 ml ，灭菌

5.2.4 混匀器

5.2.5 离心机（至少13，000 rpm，）

5.2.6 水浴箱

5.2.7 DNA 浓度测定仪（DNA 单位为ng/µl，可提供A260/280）

5.2.8 试管架（每排24孔）

5.2.9 手套规格：乳胶手套，与操作者手形相适应，经灭菌

5.3操作步骤：

5.3.1 换工作服、戴手套

5.3.1.1 从工作服衣柜中换取专用工作服，戴上适应自己手形的乳胶手套。

5.3.2 血样检查

5.3.2.1 血样应在-20℃保存，保存时间不应超过1年，无溶血、血样保存容器无破裂、无渗漏、容器盖子无松动等现象。

5.3.2.2 核对血样记录与捐献者记录，确定血样是否有效，只有有效捐献者记录的血样才能用于试验。

5.3.2.3 血样量至少1 ml。

5.3.2.4 选取满足以上要求的24个血样作为一组抽提标本。

5.3.2.5 若血样本是冻存的，请将血样在室温下孵育至其完全解冻。

5.3.3 DNA 抽提

5.3.3.1 将选取的24个血样按照编号的顺序依次放置在试管架上，每排12个，共2排。在记录本上按顺序记录样品号、抽提日期、抽提者等。

5.3.3.2 取24个1.5mlEppendorf离心管，依次放置在试管架上，每排12个，共2排，与血样一一对应，并在离心管上用油性记号笔标上对应血样的号码。

5.3.3.3 向每个离心管中加入500µl--600µlEDTA或柠檬酸抗凝血（新鲜或冻存），要求抗凝血充分混匀，不见固体悬浮物。用加样器反复吹吸血液，注意吸取血液时要求缓缓吸入，不要过快，以免血液进入加样器中，污染加样器。取900µl Solution 1加入到每管中，盖紧离心管盖子（要防止手套污染盖子内壁），充分混匀混合液，不见固体悬浮物。8000rpm 离心1分钟，从离心机中取出离心管，依血样顺序放置离心管于试管架上。

5.3.3.4 小心倒去上清液，弃之，注意不要将沉淀倒出，离心管口向下倒置在吸水纸上5秒钟，使剩余液体流出。

5.3.5 向每管中加入1000µl Solution 1,振荡混匀，使细胞沉淀打散悬浮，放置1―2分钟。8000rpm 离心1 分钟。小心倒去上清液，如同5.3.3.。

5.3.3.6 此时管中沉淀应为灰白色，如果细胞沉淀仍为红色，需重复5.3.3.5 。

5.3.3.7 每管加入240µl蒸馏水，振荡混匀，务必使细胞沉淀完全打散悬浮；再加入120µl Solution 2,用混匀器充分混匀，直至沉淀完全溶解。每管加入120µl Solution 3,反复颠倒离心管，室温下孵育5--10分钟（可以适当延长孵育时间），孵育时偶尔摇匀反应管，直至产生白色絮状。13000rpm离心5分钟，重新取24个1.5ml离心管，并依次标上对应的血样号码，依次放置在试管架上。

5.3.3.8 小心将含有可溶性DNA 的上清液转倒入对应样本号的空离心管中，不要搅动沉淀； 每管再加入120µl Solution 3，反复颠倒离心管，室温下孵育5-10分钟，13000rpm离心5分钟。

5.3.3.9 重新取24个1.5ml离心管，并依次标上对应的样本号码，依次放置在试管架上。小心将含有可溶性DNA 的上清液转倒入对应样本号的空离心管中，不要搅动沉淀。

5.3.3.10 向每管加入1ml 96%乙醇，轻轻上下翻转离心管以混合均匀，室温放置5分钟，可见到白色絮状DNA 沉淀。13000rpm 离心2分钟。

5.3.3.11 小心弃去上清液，注意不要倒掉DNA 沉淀，将离心管口向下倒置在吸附物上，使剩余乙醇流出。再向每管中加入1ml 70%乙醇，反复倒置离心管。13000离心2分钟。

5.3.3.12 小心弃去上清液，注意不要倒掉DNA 沉淀。

5.3.3.13 沉淀物为白色，打开反应管，放置10分钟，挥发残留的乙醇，干燥DNA ；或者用一次性的灭菌棉签吸干反应管中的乙醇，注意不要把白色沉淀带出。

5.3.3.14 每管加入300μl 蒸馏水，在56℃孵育10分钟。

5.3.4 DNA 浓度的测定

5.3.4.1 打开DNA 浓度测定仪开关，仪器自检通过。

5.3.4.2 具体测量步骤参见各型号仪器说明书。

5.3.4.3 在样本DNA 浓度记录单上记录日期、样品号码、浓度和A260/A280等信息。浓度测定过程中要求不同样品间更换枪头，防止交叉污染。如果A260/A280>2 表示有RNA 的污染；如果A260/A280<1.6 则表示有蛋白质的存在。要求A260/A280在1.6―2.0之间。浓度要求在10ng/μl以上才可进行扩增。

5.3.4.4 测完所有样品后，将DNA 浓度记录单的样本号与对应的装有DNA 的离心管上的样本号进行核对，保证无误后，放入冷藏冰箱或扩增。

5.3.4.5 将比色皿重复5.3.4.2操作后，放入保存液中保存。关上DNA 浓度测定仪开关，盖上防尘套。

5.3.5 DNA 抽提记录的复核

应该有2人检查血样记录、装有DNA 离心管上样本号和DNA 浓度记录单上样本号，核对其一致性，有问题应该立即查找问题原因。

5.3.6 DNA 的贮存：贮存于-20℃，注意盖紧离心管盖子

5.3.7 血样的归还： 归还已经抽提后的血样。