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DNA实验

质粒的提取和制备

2024-10-12 DNA实验 加入收藏
溶液配制(一)LB培养基每1000 ml加分析纯NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母粉5 g,用ddH2O配制,再用10 M NaOH调pH至7.4(100

溶液配制

(一)LB培养基

每1000 ml加分析纯NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母粉5 g,用ddH2O配制,再用10 M NaOH调pH至7.4(100 ml一般加450 μl),高温高压蒸汽灭菌15 min冷却后使用。

固体培养基加入琼脂1.5%。

10 M(或N)NaOH配制方法是称200 g NaOH加300 ml,搅拌充分溶解后定容至500 ml。

(二)溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

溶液Ⅰ:葡萄糖50 mmol/L,EDTA 10 mmol/L,Tris-HCl 25 mmol/L,pH至8.0。可一次配制100 ml,在1.05 kg/cm2高温高压蒸汽灭菌15 min,4℃保存。

溶液Ⅱ:NaOH 0.2 mol/L(从10 N NaOH中现用稀释),SDS 1%,用现配现用。

溶液Ⅲ:取5 mol/L乙酸钾 60 ml,冰乙酸11.5 ml,混合后ddH2O至100 ml。保存于4℃,用时置于冰浴中。

1 M Tris-HCl(pH 7.5)配制方法:Tris(MW 12.1)12.1 g 加浓HCl(MW 36.5)72 ml,调节pH到7.5并定容到1000 ml。1 M Tris-HCl(pH 8.0)配制方法:12.1 g Tris加800 ml ddH2O,用HCl(~42 ml)调pH到8.0。等溶液在室温下冷却,最后调节pH到8.0并定容到1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。

(三)酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)

按25:24:1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇,保存于棕色玻璃瓶中,上覆一层Tris-Cl水相,4℃保存备用。酚-氯仿-异戊醇混合物在100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)缓冲液下在不透光的瓶中可保存一个月之久。

(四)TE(pH 8.0)

10 mM Tris-HCl(pH 8.0),1 mM EDTA(pH 8.0),加ddH2O至1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。或用100×TE母液稀释。

(五)STE

10 mM Tris-HCl(pH 8.0),0.1 M NaOH,1 mM EDTA(pH 8.0),加ddH2O至1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。

小提质粒(碱裂解法)

1、从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(5~50 μl),接种于3 ml的LB液体培养基中(加于相应的抗生素),37℃振荡培养至OD600 大于2.0,无需过夜。

通常DH5a菌株摇12~16 hr;JM101摇7~8 hr;ER2566摇10~12 hr。

2、取1.5 ml的菌液于1.5 ml的Eppendorf管(可取未灭菌的新管)中,12000 rpm离心30 sec,弃上清。通常取1.5 ml的菌液再离心一次,弃上清后在纸上扣干。不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理。

3、加入100 μl溶液Ⅰ振荡使菌体沉淀充分悬浮,务必悬浮充分。

4、加入200 μl溶液Ⅱ,立即轻轻翻转几下,使菌体裂解。可观察到原浑浊的菌悬浮液变清变粘。

5、加入150 μl溶液Ⅲ,立即上下颠倒充分混匀7-10次,不宜太剧烈。可观察到白色片状沉淀出现。

6、置冰浴10 min,也可置于-20℃中5 min。

7、12000 rpm离心8~10 min。

8、在离心过程中可取未灭菌的新1.5 ml的Eppendorf管,加入等体积(350~400 μl即可)酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)备用,取灭菌的新1.5 ml的Eppendorf管,加入2倍体积(780 μl体积即可)的无水乙醇于-20℃备用。加酚-氯仿-异戊醇时要小心,应吸位于下层的酚相,而不要带入上层的Tris-Cl保护液。

9、离心完将上清迅速倒入已加的酚-氯仿-异戊醇中,充分混匀。小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中。


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