DNA回收问题解答

1.没有回收到 DNA 片段

如在洗脱后,发现洗脱液中没有 DNA 片段,请检查是否按瓶身标签,在洗涤液中加入了无水乙醇.

2.提取率低

(1)融胶液为酸性缓冲液,如融胶后,其pH 值升高将影响提取得率.请加入0.1 倍体积的3M乙酸钾(pH5.0).

(2)长时间使用后没有更换的电泳缓冲液,其pH 值较高,将影响DNA 的吸附.请更换新的电泳缓冲液后,再进行电泳,然后切胶.

(3)在洗脱前,将洗脱液于 30～60℃温浴,可提高提取效率.

3.吸光度测量结果问题

吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度,所以请用与洗脱液体相同的液体,对测量样品进行稀释和调零.

4.如何计算提取率

(1)由于回收前样品中,往往含有非目的 DNA 片段,引物,dNTP 等,所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率.

(2)可将回收前后 DNA 片段一起电泳,使用凝胶成像系统拍照后,用配套的软件进行电泳条带灰度对比.

(3)注意,电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响,请仔细操作,以减小误差.

5.核酸纯化的基本流程是什么？

答：胶回收的过程非常简单，电泳分离目的条带后，加入融胶液，50-60度处理几分钟，使胶彻底融化，加入EZ-resin 和结合剂，核酸将结合到树脂上，用试剂盒提供的Wash溶液洗去非特异的产物，然后用TE或水洗脱即可使用。

6.核酸纯化的基本流程是什么？

答：胶回收的过程非常简单，电泳分离目的条带后，加入融胶液，50-60度处理几分钟，使胶彻底融化，然后转移到3S离心柱中，核酸将吸附到柱底部的吸附层上，用试剂盒提供的Wash溶液洗去非特异杂质，然后用TE或水洗脱即可使用。

7.Ez-Resin和 3S column核酸纯化的主要差别是什么？

答：这两者的原理和吸附材料是不同的。EZ-resin吸附材料是硅胶基质，规模可以根据需要调整，但是批量操作相对麻烦一些，干燥需要凉干，干燥程度影响洗脱效果，当然也可以真空干燥，需要实验经验作为支撑。

3S column吸附材料是玻璃基质，柱离心式，操作比较方便，可以自动化和批量处理。在实验过程中，我们发现，用不同方式纯化的DNA,下游使用的效果有一定的差异。我们注意到用 EZ-resin纯化PCR产物，做全自动测序和TA克隆的成功率要高一些。

所以我们仍然保留了Ez-Resin纯化试剂盒。两种纯化得到的DNA,纯度和使用效果差别不大。

8.如何提高胶回收的得率？

答：根据我们的经验，Agarose抑制DNA与吸附材料的结合，将不含DNA片段多余的 Agarose切除，能显著提高回首效率。DNA结合到吸附材料，需要一定浓度的结合剂，Agarose多了，结合剂（Solution SN）的相对浓度就会下降，得率就受到影响。

有些用户抱怨产品得率不稳定。大多数情况下，是由于电泳时琼脂糖的浓度不同，切下的胶块有大有小，得率自然不同。回收的得率还与回收片段的大小有关。提高结合剂（Solution SN）的相对浓度，增加 DNA与吸附材料作用时间（放置时间），控制好离心速度都一定程度上可以提高得率。

改善洗脱条件，如提高洗脱溶液的pH值，温度，增加洗脱液的体积等也可以提高得率，但是对于pH过高，可能会影响下游反应，通常情况下采用pH8-8.5 为宜。

9.胶回收的实验次数是如何确定的？

答：有些用户抱怨试剂盒提供得试剂用量不够。通常情况下，试剂盒所提供的试剂量是规定次数试剂需要量的110%。

以3S column胶回收为例，一次实验所提供的溶液是指离心小柱子内所能容纳的最大体积,但是我们发现一些用户不根据我们的说明书使用，切的胶块非常大，为了融胶，不得不提高Solution SN的用量，到最后溶液会不够，柱子会有得多。

这是很正常的现象，有时我们会免费提供一些溶液，以免用户造成浪费。

但是有些用户利用这一点，一会讲柱子多了，请免费提供溶液，几天后又讲溶液多了，再免费提供柱子。此类人员职业道德某些方面需要提高。

10.采用Ez-resin和3S column所能回收片段的上/下限是多少？

答：根据我们实际使用情况，我们的试剂盒可以回收片段的70bp以上的片段。回收小片段时需要适当提高结合剂使用量，如将 Solution SN：Agarose的比例提高到6-7。

可以回收的最大片段是多少我们没有做过系统的分析，但是从使用情况看，回收10kb 左右的片段是没有什么问题，但是片段越大，回收的效率相对较低，DNA受损伤的可能性就大一些。

11.回收得片段为什么电泳上样会漂起来？

答：主要问题是纯化过程中的乙醇没有除干净。

12.纯化过程中乙醇或核酸结合剂（Solution S,SN,B等）不能去除干净，对下游实验有影响吗？

答：影响非常大。操作过程中有专门除残留乙醇的步骤，不可以省略，否则下游的酶切和连接都可能遇到问题。可以使核酸结合到吸附材料上的吸附剂很多，这些吸附助剂的残留对克隆影响较大。