提取土壤总DNA的几种方法

一、DNA 提取　

SDS 高盐法(方案1)

具体步骤: 称取1 g 土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨；再倒入适量的液氮，研磨，重复3 次，使土壤颗粒研成粉末； 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ，0.1 mol/L  EDTA [pH 8.0 ] ，0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ，1.5 mol/L  NaCl ，1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L  ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中，放入37 ℃恒温摇床上，225 r・min - 1振荡30 min ；加入1.5 ml20 % SDS ，轻轻混匀，65 ℃水浴加热2 h ，每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次；5 000 r・min - 1离心10 min ，将上清液转入新的50 ml 离心管中；取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆，加入0.5 ml 20 % SDS ，65 ℃水浴15 min ，用上述同样的离心速度离心10 min ，将上清液与原上清液合并；再重复此步骤1 次；用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀，5000 r・min - 1离心20 min ；收集上清液，并加入0.6 倍体积的异丙醇，室温静置1 h ；25 ℃下12 000 r・min - 1离心20 min ，倒出上清液，干燥后加入500μl 去离子水，溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质，并收集于1.5 ml 的微型离心管中。

变性剂加SDS 高盐法(方案2) 

具体步骤： 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合，加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍，10mmol/L  Tris-HCl [pH 7.0 ] ，1 mmol/L  EDTA[pH 8.0 ] ，0.5 % 2-巯基乙醇) ；液氮冰冻，研磨至溶解，重复3 次；转入50 ml 离心管中，加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] ， Tris-HCl [ pH 7.0 ] ， 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ，1.5 mol/L  NaCl ，1 %CTAB ，2 %SDS) ；65 ℃水浴1 h ，每10 min 轻轻混匀1 次；5 000 r・min - 1 离心10 min ，取上清；在原管中加入5 ml 提取缓冲液，混合后，65 ℃水浴10min ，离心，取上清，合入上述上清液；重复一次；加入等体积的氯仿混合，5 000 r・min - 1离心20 min ，取上清；加入0.6 倍体积的异丙醇，室温沉淀1 h ；20～25 ℃，12 000 r・min - 1离心20 min ，TE 溶解沉淀.

SDS-酚氯仿抽提法（方案3）

具体步骤：称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，室温振荡15min，放置冰箱30min，加125μl 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h，离心，70%乙醇清洗，200μl TE 溶解。

冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）

具体步骤：取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl ， 100 mmol/L EDTA， 200 mmol/L NaCl， 1.0% PVP， 2.0%CTAB ， PH8.0）， 加玻璃珠旋涡5~10 min，在液氮中冷却1 min后迅速在沸水中煮2 min，如此重复3次，13 000r/min离心10 min。上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50μl，轻轻混匀后，37℃温浴30min，再加入250μl SDS 缓冲液（100 mmol/l Tris-HCl， 200 mmol/l NaCl，2.0% SDS， PH8.0），上下颠倒10min，13000 r/min离心10min，收集上清夜。

二、DNA 纯化

葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化

取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50μl粗土壤DNA ，以10 min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。层析液浓缩至50μl

三、DNA的琼脂糖凝胶电泳

证明存在DNA 。

四、DNA 的纯度和定量检测

用紫外分光光度计测量纯化后的DNA 溶液在波长为230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值，分别算出A260/A230及A260/A280值。来估计DNA 的纯度。

五、纯化后土壤DNA 的PCR扩增

PCR 反应体系为50μl ，模板为1μl。PCR反应引物（放线菌通用引物）:

反应条件: 94 ℃ 3 min 预变性； 94 ℃ 1 min ， 56 ℃1 min ，72 ℃1 min ，30 个循环；72 ℃补平5 min。PCR 产物用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

六、检测扩增结果

凝胶电泳，用溴乙锭染色，在紫外光下检查结果。