DNA抽提指南

按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后，匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后，DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northern analysis的结果进行标准化，因为DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同，所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤（例如苯酚抽提等等）。] 实验所需但试剂未提供的物品： * 酒精 * 0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制） * 75%酒精 8 mM NaOH 如无例外，以下操作均应在15�30℃下完成。 1.DNA的沉淀 移除中间层上残余的水样层，用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇，反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15�30℃下2�3分钟，再在2�8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA。 小心移除水样层对抽提的DNA的质量至关重要。 2. DNA的洗脱 移除离心后苯酚层中的上清液，如有必要，可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA沉淀在15�30℃下作用30分钟（期间周期性混匀）再在2�8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后，用75%的酒精重悬DNA沉淀（每1 ml TRIZOL加1.5�2 ml75%酒精），在15�30℃下放置10�20分钟（期间周期性混匀）然后再在2�8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。 对于较大的DNA沉淀（> 200 μg）或样品中含有较多的非DNA物质需要用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）溶液再洗涤一次。[ www.bbioo.com] 3.DNA的再溶解 在开口的试管中空气干燥DNA5�10分钟。（不要用离心干燥；它会使得DNA极难溶解。）用8m M的NaOH溶解DNA，大致的比例为0.2�0.3 μgDNA/μl。一般来说，每107个细胞或每50�70 mg组织要加300�600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA是高度值得推荐的，因为抽提的DNA在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中，DNA样品（尤其是来自组织的样品）可能含有一些不溶解的胶样物质（细胞膜碎片等）。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA可以在4℃下放置过夜；如果是长期保存，样品中还应该用HEPES将pH值调到7�8（见表）并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后，dna可以保存于4℃或�C20℃。 DNA的定量及预期的产量 取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA样品，以适当比例和水混合并测量混合液A260值，以双链DNA的A260值计算DNA含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA/ml。若以细胞数分析其相应的DNA产量，大致遵循以下比例：每1×106个分别来源于人，大鼠，小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg， 6.5μg，和5.8μgDNA。 应用： 通过PCR扩增DNA： 在DNA再溶于8mM NaOH后，用0.1 M的HEPES（见表）将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。

限制性核酸内切酶酶切反应： 用HEPES（见表）将DNA溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案，也可以用pH值为7�8的1 mM EDTA透析DNA样品。每ug的DNA加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行，反应时间为3�24小时。在标准的测定中，80�90%的DNA是可被消化的。 溶于8 mM NaOH中DNA样品pH值的调整： （每1 ml 的8 mM NaOH使用以下数量的0.1 M 或1 M HEPES，游离酸。）

DNA抽提注意事项： 1.苯酚层和中间层可以在2�8℃下放置过夜。 2.溶于75%酒精中的DNA可以在2�8℃下放置数月。 3.溶于8 mM NaOH中的DNA可以在2�8℃下放置过夜，若要长期保存，将其pH值调整到7�8，并调整EDTA的浓度到1 mM。 疑难解答： DNA抽提 •每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA产量 1.肝和肾，3�4μg 2.骨骼肌，脑组织，和胎盘，2�3μg 3.培养的人，大鼠，小鼠细胞(1×106)，5�7μg 4.纤维母细胞，5�7μg •产量低 1.样品匀浆化或裂解不完全。 2.终DNA不完全再溶解。 •A260/280比值<1.70 1.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA样品。 2.DNA样品中的苯酚没有完全去除。用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）再洗涤DNA沉淀一次。 •DNA降解 1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。 2.用于抽提的样品，或已经抽提的RNA样品存放于-5�-20℃，而没有存放于-60�-70℃。 3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。 •RNA污染 1.水样层没有完全去除。 2.用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀不完全。 •其他的应用方面 在行PCR扩增前调整pH值到8.4。 对用于限制性核酸内切酶消化的DNA,调整其pH值到所需的范围，每μg的DNA加3�5单位的酶，对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3�24小时内。一般而言，80�90% 的DNA均可以被消化。