DNA实验

HRM 技术服务之突变检测

2024-10-22 DNA实验加入收藏

基因突变是指由于DNA 碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。基因突变在生物界中是普遍存在的，它是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素。但大多数基

基因突变是指由于DNA 碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。基因突变在生物界中是普遍存在的，它是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素。但大多数基因突变对生物体是有害的，如果发生基因突变，就有可能破坏这种协调关系。绝大多数的人类遗传病如人的色肓、糖尿病、白化病等遗传病，都是突变性状，是由基因突变造成的，这些病对人类健康构成了严重威胁。

目前突变研究手段比较，大致有三大类：

一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，简单的说就是以定量PCR为基础的，比如Taqman探针法、分子信标（Molecular beacon）和FRET（HybProbe），应用这一类方法时需要对突变位点背景很清楚，针对特定的突变位点设计并合成序列/位点特异性探针。

第二类是以分子杂交技术为基础的检测方法，如寡核苷酸连接分析（OLA）和动态等位基因特异性杂交（DASH），这几种方法也均涉及到序列特异性探针。

第三类是基于PCR技术与其它方法相结合的检测方法，如变性-高效液相色谱（DHPLC）、SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳）、测序、Pyrosequencing和Ecotilling、芯片等技术，这几种方法在PCR扩增的基础上对产物过柱分析，或电泳分析，无需合成序列特异性探针，不受位点的局限，可对已知和未知突变进行操作。

但DHPLC仪器昂贵，使用成本高，SSCP和DGGE通量相对较小、操作繁琐、成本高、速度慢；测序是所有突变检测的金标准，但测序的成本相当可观；Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高；Ecotilling是一种在目标区段内筛查SNP的高通量、低成本的方法，但由于需要合成特定的红外引物，所以在样本量少、研究区段多的情况下就无法体现其优势。

为真公司创新使用基于罗氏LightCycler 480的基因突变-HRM检测技术。其特点为：高通量、简单、快速、省钱、高灵敏度；闭管检测，避免污染造成的假阳性；灵敏度和精确度达到近100%；HRM分析和PCR是在同时进行，减少了额外仪器，无疑成本更低，特异性和精确度更好。

作为新一代的遗传扫描工具，HRM具有“简、效、快、廉”等其它技术难以比拟的优势：

♦ 简：无需序列特异性探针，不受碱基位点局限，同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点；闭管操作，避免交叉污染。

♦ 效：最低检测0.1%-0.01%的突变或异常甲基化，检测SNP灵敏度和特异性均为100%。

♦ 快：1次同时检测不多于384个样本，在60-90分钟内完成检测。

♦ 廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探针等方法。

HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。

突变-HRM 检测技术原理：

在一定的温度范围内将PCR 扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA 都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA 指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型和突变型基因。

不同的基因型表现为不同的HRM 熔解曲线形状

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