流式细胞术分选衰老细胞

利用流式衰老抗体染色特定组织细胞，随后根据发射光的荧光强度和波长将不同类型衰老细胞分选出来，进一步研究衰老细胞理化性质。

衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）在正常人体细胞主要表达在溶酶体，最适 pH 是 4~4.5；而在衰老细胞中，SA-β-gal 不仅大量积累，最适 pH 还偏移至 6，因此人为给予 β-gal 作用底物 X-gal 和 pH 6 的环境，衰老细胞可以在 β-gal 的作用下，将底物转变为深蓝色，利用荧光标记的 β-半乳糖苷酶底物即可利用流式将衰老细胞分选出来。

利用流式分选衰老细胞，可研究细胞周期，以及探究细胞衰老在肿瘤抑制、肿瘤进展、衰老以及组织修复中的功能。

剪刀、镊子、六孔板、300 目滤网、移液枪

移液管、15 ml 离心管、流式管

1640 培养基、胎牛血清（FBS）

衰老细胞流式抗体

1、使用颈椎脱臼法处死小鼠后，取小鼠脾脏。

2、将脾脏放入预加有 3 ml 10% FBS 的 1640 培养基及灭菌后的 300 目滤网的 6 孔板中。轻柔地研磨组织，将研磨好的细胞悬液经 300 目滤网过滤到 15 ml 离心管中，用 3 ml 10% FBS 的培养基洗孔板两次，1500 rpm，4 ℃，离心 5 min。

3、弃上清，用 2 ml 红细胞裂解液进行裂解红细胞，常温 5 min。

4、加入 5 mL 10% FBS 的 1640 培养基中和，1500 rpm，4 ℃，离心 5 min。

5、弃上清，使用 10 ml PBS 洗涤细胞，经 300 目滤网转移到新的 15 ml 管中，计数，1500 rpm，4 ℃，离心 5 min。

6、弃上清，用含 2% PFA 的 PBS 重悬细胞，使细胞浓度为 1×107 cells/ml，室温避光固定 10 min；

7、随后按 1:5500 比例稀释 Dilute the CellEventTM Senescence Green Probe 进行衰老细胞流式染色，37 ℃ 染色 2 h。

8、染色后用含 1% BSA的 PBS 洗涤细胞一到两次；

9、最后 1 ml 10% FBS 的 1640 培养基/107 cells 的比例重悬细胞，过 300 目滤网至流式管，上机分选，10% FBS 的 1640 培养基收集。

1. 为保持细胞活性，细胞悬液制备过程尽量冰上操作，且使用 10% FBS 的 1640 培养基。

2. 多色流式染色时，为了使细胞分群明显，尽量挑选荧光通道波长相差大的流式抗体。

3. 上机分选时，先建单染管确定电压，并调节补偿，才能使分群明显，保证分选效率。